牙龈卟啉单胞菌培养及中药抑菌试验

刘小冬

（北京市顺义区动物疫病预防控制中心 100300）

牙龈卟啉单胞菌是拟杆菌属的一种革兰氏阴性球杆菌，严格厌氧环境下生存，并且有很强的致病性。在血琼脂培养基上形成黑色凸起，光滑有光泽的菌落。对于临床常见的一些药物，克林霉素，四环素等对牙龈卟啉单胞菌有比较强的抑制作用，而青霉素等药的作用很小。本次研究将着重于中药对牙周病的主要致病菌之一的牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用。临床上有很多关于中药能有效抑制Pg 的成果，其中单味中药、中药提取物和复方药液都有一定作用，并且已经有试验说明其在临床方面的作用。实验结果显示厚朴、茶多酚、菊花、桑叶、川芎嗪、金银花、丁香、香薷、乌梅、荷叶、黄芩、丹皮、紫苏叶、广藿香、黄连、五倍子、白芍、五味子、佩兰、龙胆苦甙、山姜、大黄、连翘、普通绿茶、龙井茶、红茶、茉莉花茶、紫阳茶、乌龙茶、艾叶、侧柏叶、蒲黄、三七、仙鹤草、桂皮醇、银杏等含有小檗碱、黄芩素、大黄酸、厚扑酚等有效成分的中药对牙龈卟啉单胞菌在一定浓度下都具有十分明显的抑菌作用[2]。

1 牙龈卟啉单胞菌的培养

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

涂布器，牙龈卟啉单胞菌标准株ACCT33277（由广东省微生物保存中心提供），普通血琼脂平板，巧克力平板，BHI 培养基粉，氯化血红素，酵母提取物，5%无菌脱纤维羊血，2.5L厌氧培养袋（爱普锐晟试剂耗材公司提供），厌氧产气袋，厌氧指示剂（日本三菱），维生素K1（中国农业大学动物医院提供）。

1.1.2 仪器

超净台，高压蒸汽灭菌锅，光学显微镜（DM500，Leica），37℃恒温箱。

1.1.3 培养条件

37℃，厌氧环境（78%N2，21%CO2）。厌氧环境由厌氧产气袋和厌氧密封袋组成，环境温度由恒温箱控制。因此，环境控制存在一定的波动变化，厌氧产气袋需要一些时间去创造一个良好的厌氧环境，此期间会在一定程度上影响厌氧菌的生长繁殖。

1.1.4 菌种复苏

冻干粉全部用完，用0.2mL 的无菌水溶解，接种在2 个血琼脂平板上。因冻干菌种处于休眠状态，故不接种多个平板，以免因接种量不足而导致复苏不成功。

1.1.5 菌种初步鉴定

眼观：琼脂板上形成棕色或灰色菌落，后转为黑色菌落，紫外照射有红色荧光。显微镜镜检：革兰阴性球杆菌，大小为（0.8～1.5μm）×（1.5～3.5μm），两端圆，染色不均。

生化特性：吲哚试验阳性，脂酶试验阴性，不发酵葡萄糖等糖类，触酶试验阴性，α岩藻糖苷酶，α半乳糖苷酶，β半乳糖苷酶试验阴性。

1.1.6 后续培养

洗脱：移液枪吸取1mL 的无菌蒸馏水，按压移液枪将蒸馏水快速挤出到培养基平板表面，将培养基倾斜，吸取培养基表面的液体反复洗脱培养基表面菌落，反复洗脱操作10 次。将洗脱液用移液枪吸取后装入无菌EP 管里静置3～5min，除去肉眼可见的黑色沉淀（黑色小菌落），放入另外一个无菌EP 管里混匀备用。

取初代复苏的细菌，在传代 3 代之后用洗脱液50μL 分别涂布在普通血平板，巧克力平板，改良BHI 血平板上培养。（根据菌种说明，在传代3 代后达到稳定生长繁殖的状态。）

改良BHI 血平板（100mL）：3.6gBHI 培养基粉末+0.5g 酵母粉+1.5g 琼脂粉，加入100mL 水溶解后高压灭菌20min，等待其温度降到不烫手时加入5mL 5%无菌脱纤维羊血，500μL 氯化血红素，100μL 维生素K1，混匀后倒平板。

1.2 培养结果

1.2.1 复苏用了14d 长出成片的黑色团块，复苏成功。

1.2.2 传代3 次之后能平稳生长繁殖后洗脱后接种血平板，早上接种，第6d 晚上血平板开始变色，第12d 晚上长出肉眼可见菌落。巧克力平板培养基颜色变化不明显，但是长出菌落的时间提前了平均半天。改良后的BHI 血平板菌落长出最快，在第10d 晚上可长出小的肉眼可见菌落。

1.3 分析与讨论

牙龈卟啉单胞菌的生长周期较同期试验的变形链球菌来说，形成菌落的时间很慢。由于没办法做到文献中厌氧的气体条件，对于牙龈卟啉单胞菌的生长会产生影响。培养基中加入氯化血红素和维生素K1 后加快细菌的生长以及黑色素的产生这点符合文献记载[3]。

2 中药抑菌性的探究

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

6 种中药的中药配方颗粒。黄芩（1∶10，三九医药），黄芪（1.5∶10，江阴天江药业有限公司），连翘（1∶10，三九医药），金银花（2∶10，三九药业），五倍子（2.5∶5，三九医药），五味子（1.5∶6，三九医药）。

2.1.2 仪器

96 孔板，超微量分光光度计（NanoDrop 2000C，Thermo Scientific），37℃恒温箱，电磁炉和锅，0.22μm 滤器（密理博）。

2.1.3 方法

2.1.3.1 中药液的配制

（1）称取中药免煎颗粒

药物名称黄芩黄芪连翘金银花 五倍子 五味子取样重量（g）0.502.501.251.000.500.75

（2）配制中药配方颗粒0.5g/mL 的10mL 中药液。在5g 中药配方颗粒加入5mL 加热后的蒸馏水在恒温80℃状态下溶解，转移到相应编号的试管内，再加入5mL 蒸馏水混匀。

（3）高压蒸汽灭菌。

（4）用0.22μm 滤器过滤后备用（避免药渣沉淀影响试验结果观察）。

药物名称黄芩 黄芪连翘金银花 五倍子 五味子过滤后收集到的药液量（mL） 647.5899

2.1.3.2 中药抑菌试验

（1）探究抑菌浓度：取100μL 中药液和100μL 增菌到105-6 菌液加到96 孔板内混匀，设置对照组（菌液+蒸馏水，中药+培养液）。培养24h 观察结果。由于变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌都是牙周疾病主要致病菌且适宜生长条件相似，但变形链球菌的生长周期更短，用于探索可以抑菌的浓度的预实验。

判定标准:

MIC：最小抑菌浓度 (Minimum Inhibitory Concentration)，96孔板底部无菌落生长的最小稀释孔对应中药浓度为MIC。

MBC：最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration），用96 孔板底部无菌落生长的混合液涂布平板，若一定时间培养之后未见细菌生长的，则为MBC。

（2）牙龈卟啉单胞菌中药抑菌效果试验

将洗脱液100μL 均匀涂布在培养基表面培养10d，测量培养基表面的菌落数后计算需要稀释原洗脱液的倍数。按照比例稀释原洗脱液后分装备用。

配置预试验MIC 浓度以及前后两个梯度的中药液，用滤器过滤后先取100μL 均匀涂布在培养基表面，在接入100μL 牙龈卟啉单胞菌洗脱液。培养10d 之后观察抑菌效果。空白对照为只有细菌洗脱液涂布的平板。

2.2 抑菌试验结果

2.2.1 不用滤器过滤之前中药沉淀严重，看不到细菌生长的情况。用分光光度计测量，沉淀对测量的影响大于细菌在混悬液中生长的影响，实验结果不具有参考价值。

2.2.2 用了滤器之后，得到基本稳定的数据（换算成中药饮片的浓度）。

MIC：黄芩1.66g/mL，五倍子0.125g/mL，五味子0.125g/mL，金银花1.25g/mL，连翘1.25g/mL，黄芪3.33g/mL。

MBC 黄芩未测得完全抑菌浓度，五倍子1g/mL，五味子1g/mL，金银花2.5g/mL，连翘5g/mL，黄芪未测得完全抑菌浓度。

2.2.3 对牙龈卟啉单胞菌有抑菌作用的浓度是黄芩1.66g/mL，五倍子0.078g/mL，五味子0.078g/mL，金银花0.78g/mL，连翘0.78g/mL，黄芪3.33g/mL。在不同药液的不同浓度下表现的抑制作用各有不同。表现为测得的抑制浓度下有不同的抑制效果，其中抑制浓度下五倍子和五味子的平板上菌落密度最小，呈较好的抑制效果。

2.2.4 标准浓度1g/mL 和0.5g/mL 作用下，五倍子和五味子的抑菌作用最明显。表现为五味子＞五倍子＞金银花＞连翘＞黄芩＞黄芪。

2.3 分析和讨论

中药配方颗粒的溶解会带来很多沉淀，没有用中药饮片煎制过滤之后浓缩做出的结果具有说明意义[4]。对变形链球菌，五味子和五倍子对细菌的抑制作用明显强于另外几种中药，黄芩和黄芪两种中药对其的抑制作用最低。在抑制变形链球菌的药物浓度下，牙龈卟啉单胞菌呈很好的抑制状态，表现为平板上没有长出肉眼可见的菌落或者很少的菌落。接下来几天菌落大小的变化是由中药抑菌作用和培养基营养等因素共同影响。菌落密度的变化在接下来的时间表现不明显，说明在抑制浓度下中药成分的抑菌性在一定时间内能长时间发挥作用，抑制作用持续一段时间后会渐渐减弱。在实验室有了更多厌氧菌培养的装置和经验之后可以尝试有机溶剂制作中药液并提取有效成分。并且为了减少沉淀，试验中尝试用了滤器进行过滤，虽然很有效地减少了沉淀的产生，但是也过滤了一些有效物质，对抑菌作用有很大影响。不过，还是依旧能测出来具有稳定性的实验结果。本次试验结果与文献中所述一致，五倍子和五味子的抑菌效果比其他几味中药更好，不管是控制了中药浓度情况下还是从抑菌浓度方面来说。此次试验说明了中药确实对牙周疾病致病菌牙龈卟啉单胞菌有明显抑制作用，可以为以后制造中药抑菌制剂提供理论依据。

3 结论

如文献所说，中药的成分的多种多样，这样的好处是能更好的起到作用，坏处是对于研究的定量来说，各种物质的不同作用能力让中药不能更精确的定量分析。这也是中药研究的一大难点。近年来，中药在肿瘤，抑菌等领域都有确实的数据说明中药在治疗方面确实起到了一定作用，但是对于其中的作用物质和作用机制研究还不够深入，并且试验方法单一，缺乏创新性。中药研究的重点应该向更精确方面发展。在临床方面，根据本试验的结果，加上中药能减少产生耐药性的方面，中药能很好抑制牙周致病菌的生长和菌膜的形成，可以考虑制作中药配方制剂用于犬的牙周病防治。