牛蒡子粗多糖的提取及其体外抗氧化活性研究

龚 频， 胡峰瑞， 高浩天， 杨文娟， 常相娜， 陈福欣

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)

0 引言

牛蒡子(Fructusarctii)又名“大力子”、“鼠粘子”、“恶食”等，是菊科植物牛蒡的干燥成熟果实[1]，具有清热解毒、利咽透疹的功效，证见风热表症兼喉咙肿痛者，临床上常用于风热感冒、咽喉肿痛、肺热咳喘、疽肿痄腮等疾病[2].牛蒡子具有抗癌[3,4]、抗糖尿病[5]、抗炎[6-8]、调节免疫功能等多种药用价值[9,10]，含有木脂素、挥发油类等多种化学成分[11,12]，目前对牛蒡子的研究多集中在木脂素类化合物，对多糖的研究尚不深入.多糖作为天然生物大分子，具有抗肿瘤[13]、降糖[14-16]、抗氧化[17]、抗病毒[18]、保护神经[19,20]等广泛的生物活性，近些年来被广泛研究和应用.

多糖提取的方法主要有热水回流浸提法、酶辅助提取、微波辅助提取、超声辅助提取等.热水回流提取法操作简单，但耗时长，提取率低，且长时间高温会使糖降解.酶辅助提取法具有条件温和、高效、工艺简单、成本低的优势，但受酶活性影响较大[21].超声提取利用超声波使细胞快速破裂，促进内容物释放，其操作简单、提取率高，被广泛应用于多糖的提取[22].

本研究以牛蒡子为原料，通过响应面优化超声辅助提取牛蒡子粗多糖的工艺条件，并对其抗氧化性进行研究，为牛蒡子多糖的开发和利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 主要材料

牛蒡子，北京同仁堂；石油醚、无水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、氯化钠、无水葡萄糖、浓硫酸、苯酚、抗败血酸(Vc)、铁氰化钾、三氯化铁、浓盐酸、邻苯三酚、三氟乙酸，天津市天力化学试剂有限公司；DPPH，美国Sigma公司.

1.1.2 主要仪器

HC-150T2型高速多功能粉碎机，永康市绿可食品机械有限公司；KQ-250超声波清洗机，昆山市超声波仪器有限公司；RE52CS型旋转蒸发仪， 上海亚荣生化仪器厂；H-1850R型台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；T2600型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 牛蒡子粗多糖的制备

牛蒡子粉碎过筛，经石油醚、乙醇除脂脱色后晾干备用.取2 g药材粉末，按料液比加入蒸馏水，在设定温度下超声辅助提取一定时间后抽滤，提取2次，合并滤液并浓缩至原体积的1/4，再加4倍体积95%乙醇，于4 ℃沉淀24 h，离心，沉淀用蒸馏水复溶，冷冻干燥后得牛蒡子粗多糖.

取在最优条件下提取的牛蒡子粗多糖，蒸馏水复溶至合适浓度，使用sevage试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)进行脱蛋白[23]处理.

1.2.2 牛蒡子粗多糖得率测定

采用苯酚-硫酸法[24]测含糖量，通过葡萄糖标准曲线计算多糖浓度.按照式(1)计算出牛蒡子粗多糖得率：

(1)

式(1)中：C为多糖浓度(g/mL)，V为溶液的总体积(mL)，n为稀释倍数，W为牛蒡子干粉质量(g).

1.2.3 单因素实验

设置基础实验条件为超声时间为60 min，提取温度为70 ℃,料液比1∶20.考察超声时间(20、40、60、80、100 min)、提取温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)以及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对牛蒡子粗多糖得率的影响.

1.2.4 响应面优化试验设计

根据单因素的实验结果，以超声时间、提取温度和料液比为自变量，以牛蒡子粗多糖得率为响应值Y，通过BOX-Behnken Design(BBD)设计方案.

1.2.5 体外抗氧化活性检测

(1)自由基清除能力检测

检测牛蒡子粗多糖对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子的清除率.分别配置牛蒡子粗多糖和Vc溶液(不同浓度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL)，调整已有方法[25]测定DPPH自由基清除能力.取不同浓度的粗多糖和Vc溶液2 mL置于具塞刻度试管中，加入0.05 mg/mL的DPPH无水乙醇溶液2 mL，摇匀，室温避光放置30 min后，于517 nm波长处测吸光度；

参照文献[26]中所述方案并进行调整来测定羟基自由基清除能力.取不同浓度的粗多糖和Vc溶液2 mL置于具塞刻度试管中，依次加入2 mL硫酸亚铁溶液(9 mmol/L)、2 mL水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)和2 mL过氧化氢溶液(9 mmol/L)，摇匀，37 ℃水浴30 min，冷却至室温后于510 nm波长处测量吸光度；

超氧阴离子的清除能力参考已报道的方法[27].取不同浓度的粗多糖和Vc溶液各200μl于具塞刻度试管中，加入3 mL Tris-HCl溶液(0.1 mol/L)，37 ℃水浴加热10 min，加入12μL邻苯三酚溶液(30 mmol/L)反应4 min后立即加入0.5 mL浓盐酸终止反应，于320 nm波长处测量吸光度值.各试验以Vc为阳性对照，每个样做3个平行，按照公式(2)计算样品对每种自由基的清除率.

(2)

式(2)中：A2为样品溶液的吸光度；A1为样品本底吸光度；A0为空白对照吸光度.

(2)总还原力检测

配置不同浓度的牛蒡子粗多糖和Vc溶液，总还原力的测定参照文献报道的方法[28]，以Vc作为阳性对照，每个样本平行3次，于700 nm处测吸光度.

1.3 数据处理

各试验平行3次，使用Microsoft Excel 2020、Design-Expert 8.0.6和Origin 8.5软件对单因素试验、响应面试验和抗氧化试验的数据进行处理和绘图.

2 结果与讨论

2.1 超声时间、提取温度、料液比对粗多糖得率的影响

超声时间对牛蒡子粗多糖得率的影响见图1(a)所示.由图可知,随超声时间的增加，多糖得率逐渐上升，在60 min时达到最高，随之又开始逐渐降低，或是因为超声时间的延长使得多糖结构被破坏[29].最优的超声时间为60 min时得率最高为13.19%.

提取温度的改变对牛蒡子粗多糖得率的影响见图1(b)所示.由图可知,初始时多糖得率随温度的增加而增加，在提取温度达到80 ℃时多糖得率达到最大值13.98%，而过多糖得率开始降低，推测提取温度过高可能会导致多糖结构会被水解破坏[30].初步确定最优的提取温度是80 ℃.

料液比的改变对牛蒡子粗多糖得率的影响见图1(c)所示.由图可知，在低于1∶25 g/mL时，多糖得率随料液比的增加而增加，在料液比达到1∶25 g/mL时多糖得率达到最大值13.81%，而后随着料液比的增加多糖得率开始降低，可能是因为多糖极性大，易溶于水，料液比太小会溶出不完全，而料液比过大会导致其他水溶性物质溶出.因此最优的料液比选择为1∶25 g/mL.

(a)超声时间对牛蒡子粗多糖得率的影响

(b)提取温度对牛蒡子粗多糖得率的影响

(c)料液比对牛蒡子粗多糖得率的影响图1 超声时间、提取温度、料液比对多糖得率的影响

2.2 响应面优化试验结果

通过BBD设计出牛蒡子粗多糖的优化工艺方案进行多元回归拟合，获得多糖得率响应值Y对超声时间(A)、提取温度(B)及料液比(C)的回归方程：

Y=14.21+0.47A+0.2B+0.068C-0.24AB+0.14AC-1.61A2-0.22B2-0.51C2.

采用Design-Expert对模型进行方差分析，结果表明(表1)，该模型的P<0.000 1，具有极显著性，失拟项不显著(p=0.315 4)，R2=0.996，可信度极高，说明模型可用于优化提取多糖的工艺.一次项A和B、交互项AB以及平方项A2、B2、C2的P值都小于0.01，说明各因素对牛蒡子粗多糖得率具有极显著的影响，且影响的主次顺序为A>B>C，即超声时间>提取温度>料液比.

表1 回归方程方差分析

通过Design-Expert分析各因素交互作用的响应面分析图见图2所示.相应曲面图越陡峭，坡度越大，说明因素交互作用越显著，反之越平缓，坡度越小，说明交互作用显著性越低[31].图2结果表明，超声时间曲线变化最大，对多糖提取率的影响最明显.响应曲面图弯曲程度为AB>AC>BC.提取时间和提取温度响应面坡度最陡峭，等高线呈椭圆状，说明其对多糖的提取率影响最为显著.

(a)超声时间和提取温度响应面

(b)超声时间和提取温度等高线图

(c)超声时间和料液比响应面

(d)超声时间和料液比等高线图

(e)提取温度和料液比响应面

(f)提取温度和料液比等高线图图2 两两因素交互作用对牛蒡子粗多糖得率的响应面和等高线

2.3 最佳工艺验证

Design-Expert预测牛蒡子粗多糖的最优提取工艺条件为超声时间62.42 min、提取温度为83.89 ℃、料液比为1∶25.42 g/mL，该条件下牛蒡子粗多糖得率为14.28%.根据实际条件调整提取工艺条件为超声时间63 min、提取温度为84 ℃、料液比为1∶25 g/mL，在该条件下进行实验验证，平行3次，所得到的牛蒡子粗多糖平均得率为14.02%，验证结果与预测值相近，说明该模型所优化的工艺参数准确可靠、稳定可行.

2.4 牛蒡子粗多糖抗氧化活性

DPPH可以被具有抗氧化性的活性物质清除，且自由基清除率与该物质抗氧化能力呈正相关.由图3(a)可知，Vc具有很强的清除能力，牛蒡子粗多糖对DPPH也呈现出一定的清除能力，并且在一定的浓度范围内存在量效关系.在最高浓度下清除率达到58.89%；羟基自由基性质活泼，得电子能力极强，是活细胞中主要的活性氧自由基.

牛蒡子粗多糖对羟基自由基清除能力检测结果如图3(b)所示.从总体趋势来讲，随着多糖浓度的增加，羟基自由基的清除率呈上升趋势.但与阳性对照Vc相比清除效果较弱，在最高浓度下清除率达到63.61%；超氧阴离子会损伤机体组织和细胞功能，具有强氧化性.

牛蒡子粗多糖对超氧阴离子的清除能力检测结果如图3(c)所示.由图可知，不同浓度Vc对超氧阴离子清除率较高，FAP对超氧阴离子有一定的清除能力，且在一定的浓度范围内存在量效关系,在最高浓度下清除率达到82.53%.

牛蒡子粗多糖对铁离子的还原能力检测结果如图3(d)所示.由图可知，随着浓度的升高，还原能力逐渐增大.但其还原能力与阳性对照Vc相比明显较弱，在最高浓度下还原能力达到0.197 5.

(a)牛蒡子粗多糖对DPPH的清除率

(b)牛蒡子粗多糖对羟自由基的清除率

(c)牛蒡子粗多糖对超氧阴离子的清除率

(d)牛蒡子粗多糖对铁离子的还原力图3 牛蒡子粗多糖对DPPH、羟基自由、超氧阴离子的清除率和对铁离子的还原能力

3 结论

(1)通过超声辅助-水提醇沉法获得牛蒡子粗多糖，通过单因素实验和响应面优化实验获得牛蒡子粗多糖最佳制备工艺参数为超声时间63 min、提取温度84 ℃、料液比1∶25 g/mL，在该条件下制备的牛蒡子粗多糖得率可达到14.02%.

(2)通过对DPPH自由基、羟基自由基及超氧阴离子的清除能力和铁离子还原能力的检测，评价了牛蒡子粗多糖的体外抗氧化活性，结果说明牛蒡子粗多糖具有良好的抗氧化活性.

(3)通过研究牛蒡子粗多糖的提取工艺和抗氧化活性，为牛蒡子多糖的开发利用提供了具体的科学理论基础，为牛蒡子多糖保健食品、药品的开发提供了理论依据，对进一步挖掘牛蒡子的资源应用提出新思路.