骨钙素内分泌调控功能研究进展

杜张珍，李 旭，王 妍

（1.军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100850；2.中国医科大学附属第一医院，辽宁沈阳 110000）

骨钙素（osteocalcin，OCN）常被作为成骨细胞骨形成的血清标志物，最初被认为只是一种非胶原蛋白，参与骨基质形成和骨基质矿化调控。生理状态下，骨钙素存在完全羧化OCN（carboxylated OCN，cOCN）和不全羧化OCN（undercarboxylated OCN，ucOCN）2种形式，各具有不同的生物学功能。cOCN具有很强的钙亲和能力，主要与钙离子结合沉积于骨骼肌系统；ucOCN可进入血液参与血循环，对多器官功能发挥调控作用。近10年来，关于成骨细胞内分泌调控作用的研究有较多报道，重点为骨源性OCN的作用[1]。随着对ucOCN功能的深入研究，人们逐渐认识到OCN的低羧化形式可能正是其发挥“内分泌激素样”调控作用的执行体，平衡并维持机体稳态，与多个器官形成能量调控环路。本文重点介绍OCN的多元化内分泌调控作用，以期为深入研究OCN作用机制并将其作为一种潜在的内分泌激素药物治疗代谢、认知障碍及老年退行性疾病提供参考。

1 骨钙素的生物学特征

OCN也称为骨γ-羧谷氨酸（Gla）蛋白，是一种含46～50个氨基酸的可分泌蛋白，主要由成骨细胞产生[2]。牙齿的成牙本质细胞和肥大的软骨细胞也能产生少量OCN。近年来研究表明，在肾和脑组织中也有OCN表达。包括人类在内的大多数生物体中，OCN由一个物种间高度保守的基因编码，但不同种属的OCN表达形式不尽相同。人OCN基因位于1号染色体1q25～q31，专司编码98个氨基酸、分子质量为11 ku的OCN前体蛋白。小鼠含有3个ocn基因簇，其中ocn基因1（ocngene 1，og1）和og2主要在骨中表达，ocn相关基因（ocn-related gene，org）主要在肾组织中表达。目前org的确切功能尚不清楚，有人认为其编码一种与钙结合的Gla蛋白质，在维持钙稳态中发挥重要作用[3]。

OCN的成熟依赖于羧化酶对其特异位点进行羧基化反应。尚未成熟的OCN在氨基酸序列的17，21和24位有3个羧化酶识别位点，在与γ-谷氨酰羧化酶（gamma glutamyl carboxylase，GGCX）的单次结合过程中，逐步对这3个位点的谷氨酸残基进行γ羧化修饰[2，4-5]，进而转化为成熟OCN。这种羧化反应过程依赖维生素K循环提供二氧化碳，并将氧气作为辅助因子。每一个γ羧化循环将维生素K转化为环氧化物，随即又被维生素K环氧化物还原酶还原，重启另一轮羧化过程[6]。成熟的cOCN蛋白被包装成细胞内小泡，以囊泡输运的方式分泌到骨基质中[7]。几乎所有维生素K依赖的Gla蛋白均具有钙结合能力和相同的γ羧化酶识别位点，因此它们被认为是从一个共同的祖先进化而来[5]。在凝血中发挥作用的肝Gla蛋白与钙连接的磷脂结合，而OCN与羟基磷灰石中的钙离子结合[8]。OCN的钙亲和性在一定程度上决定了OCN的功能，当骨基质中的OCN在一定条件下脱羧转变为ucOCN，失去这种与钙离子的亲和能力，随血液进入血循环系统，参与对机体多器官的稳态调控。

2 骨钙素受体

在循环系统中虽能够同时检测到cOCN和ucOCN，但只有ucOCN发挥多器官靶向调控作用[9-10]，通过激活靶细胞膜受体介导生物学功能。目前已证实其存在2个潜在的G蛋白偶联受体：G蛋白偶联受体C家族6组成员a（G protein-coupled receptor，family C，group 6，member A，GPRC6A）和G蛋白偶联受体158（G protein-coupled receptor 158，GPR158）。前者主要在除脑以外的外周组织表达，介导ucOCN在脂肪、胰腺和生殖器官的功能；后者主要由脑海马区微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）阳性细胞表达，介导ucOCN在脑内的调控作用[11]。

GPRC6A是一种G蛋白偶联受体，在对循环OCN产生反应性的多种组织类型细胞上均有表达[12]，可被钙和锌等阳离子配体激活[13-14]。基因敲除研究显示，GPRC6A功能缺陷导致的生物表型与ocn缺失小鼠极其相似，表现为体内脂肪积累、高血糖、葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和睾酮水平降低等[15]。Oury等[16]在研究OCN在睾丸间质细胞中所激活的信号通路时，发现OCN能够持续增加睾丸间质细胞中cAMP水平，并最终锁定OCN的一个受体即GPRC6A[17-18]。在胰岛β细胞中，OCN也是通过GPRC6A受体激活MAP激酶途径发挥作用[19]。早期研究结果提示，GPRC6A介导了OCN在其他组织中的功能，包括肌肉、脂肪和骨，并在后续的研究中相继得到证实[20-24]。

gprc6a敲除小鼠导致行为学异常却并不影响小鼠神经递质释放，表明OCN在神经系统可能还存在其他受体[25]。以如下3个标准作为筛选受体的依据：①与GPRC6A相同，这种新受体应属于G蛋白偶联受体；②应存在于曾被证明能与OCN结合的海马CA3区；③不应在GPRC6A介导OCN信号的其他细胞中表达。Khrimian等[11]于2017年鉴定出GPR158为ucOCN在脑中的特异性受体，随后在gpr158和ocn联合敲除小鼠中均发现该受体介导了OCN对海马依赖性记忆和焦虑样行为的调节。值得注意的是，GPR158在OCN结合的脑干中缝背侧和内侧的5-羟色胺能神经元中不表达，提示OCN还有可能存在其他受体，有待在今后的研究中阐明。

3 骨钙素生物学功能

3.1 在骨基质生物矿化中的作用

目前OCN在骨基质中的功能研究结果尚不一致，确切作用还不十分清楚。OCN通常被作为成骨细胞骨形成的血清标志物[7，26]，促进骨基质矿化[27]。成熟OCN被分泌到骨微环境中，随即发生构象变化，其具有钙结合能力的Gla残基与羟基磷灰石中的钙离子结合，沉积于骨基质中。这种特性最初被认为是一种OCN启动的羟基磷灰石晶体形成的机制[28-29]。然而随后的研究表明，OCN可作为骨矿化的抑制剂发挥作用。ocn基因全敲除的小鼠骨皮质厚度增加，生长板周围有丰富的钙化区[30]。此外，OCN能抑制饱和溶液中钙盐的沉淀[31]。长期对啮齿动物给予一种能够间接影响OCN功能的维生素抑制剂华法林（warfarin），易导致骨过度矿化和生长板过早闭合[32]。利用傅里叶变换红外显微分光光度法对骨基质分析显示，在年龄较大的ocn基因敲除小鼠中，矿物质与基质的比率增加，羟基磷灰石的晶体尺寸更大，这表明OCN可能调节矿物质的成熟率[33]，然而ocn敲除小鼠成牙牙本质却表现正常[34]。对骨中过表达OCN蛋白的小鼠骨组织分析显示，其骨基质矿化状态也相对正常[35]，提示体内OCN可能存在自身稳态调节。

OCN参与骨矿化的机制或许更复杂，但值得注意的是，当前这些研究并未将cOCN和ucOCN的功能区分开来，OCN的作用可能是2种形式相应功能共同叠加的结果，而在不同的生理病理过程、不同组织类型或不同的进程阶段可出现看似相矛盾的结果，如在ocn基因敲除的小鼠骨质中，OCN显示出的综合作用为抑制骨矿化[30]，但在动脉粥样硬化的钙化斑块中却检测到丰富的OCN表达[36]；在内皮细胞中过表达OCN，同样能加重股动脉粥样硬化的进程[37]；而血清中ucOCN水平增加或应用重组ucOCN分子则能够抑制动脉粥样硬化进展[38-39]。虽然OCN可能通过促进全身代谢影响血管相关疾病的发展，但这些研究也从侧面印证将不同形式的OCN区分研究，更有助于全面阐明OCN功能及其在机体代谢调控中的作用。

3.2 在能量代谢中的调控作用

最先受到关注的ucOCN多器官调控功能是其在能量代谢中的作用。Lee等[40]研究发现，ocn完全敲除后小鼠出现脂肪积聚和明显的葡萄糖代谢受损。随后，Fulzele等[41]研究印证了特异性敲除成骨细胞的胰岛素受体（insulin receptor，ir）小鼠产生一种与ocn缺失相类似的代谢表型，即体内脂肪积累、高血糖、低血清胰岛素、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受；成骨细胞ir突变小鼠注射OCN可改善葡萄糖代谢水平；此研究明确了ocn是成骨细胞主要的胰岛素反应基因。进一步研究表明，OCN可通过促胰岛β细胞增殖、增加靶细胞对胰岛素的敏感性进而调控糖脂代谢[42]。此外，OCN可通过促进肝糖原分解，逆转非酒精性脂肪肝[43-44]。最近有研究报道，血管内皮细胞特异性敲除脂蛋白相关受体可激活OCN表达，促进内皮细胞糖代谢[45]。上述研究进一步表明OCN对能量代谢的促进作用。

Ferron等[46]报道，胰岛素对ucOCN存在反馈调节，简言之这是一种胰岛素相关且pH依赖的破骨细胞活化机制。IR是一种酪氨酸激酶，可被蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）抑制。由小鼠胚胎干细胞磷酸酶（embryonic stem cell phosphatase，esp）基因编码，在成骨细胞和睾丸支持细胞表达的骨睾PTP（osteotesticular PTP，OST-PTP）是PTP的一种。分析OSTPTP催化结构域提示其与PTP1B等磷酸酶具有同源性[47]，后者常作用于IR使其去磷酸化而失活。esp-/-小鼠表现出胰岛素分泌增多，靶器官对胰岛素敏感性以及糖代谢能力显著增强，同时伴随着循环ucOCN比例明显提升[47]。后续研究表明，esp-/-小鼠胰岛素信号途径激活可增强破骨细胞活性，而破骨细胞所在吸收腔隙的低pH环境进一步促进OCN脱羧并释放到血循环中[48]。一旦破骨细胞的功能受损，如临床骨质疏松症患者以及相应模型小鼠体内，ucOCN水平也处于较低水平，并表现出糖耐量异常[49]。综合上述研究提示，胰岛素和OCN之间可能存在正反馈环路，即胰岛素介导OCN生成，并促进其脱羧，继而ucOCN入血刺激胰岛β细胞增殖并分泌更多胰岛素。

目前关于胰岛素在转录水平刺激OCN产生的分子机制已有相关研究报道。叉头盒转录因子O（fork head box O，FoxO）是介导胰岛素功能的主要调控分子[50]。Rached等[51]在ocn基因中鉴定出3个FoxO结合位点，并发现FoxO1是OCN表达的有效抑制因子。敲低成骨细胞FoxO转录因子的小鼠血液中OCN含量增加，同时表现出胰岛β细胞增殖、胰岛素分泌和靶器官对胰岛素敏感性增加[51]。FoxO1可能通过与转录激活因子4相互作用介导对OCN表达的抑制作用[52]，转录激活因子4负性调控成骨特异性转录因子2，进而抑制OCN的生物活性[53]。此外，相继发现了对OCN具有调控作用的其他信号通路，如结节性硬化复合物2（tuberous sclerosis complex 2）基因敲除小鼠成骨细胞中mTOR信号出现下调，同时ucOCN水平较对照组提高10倍，并最终对激素脱敏[54-55]。在成骨细胞发育中起重要作用的Fos相关抗原2（Fos-related antigen 2，Fra-2）和维生素K依赖性GGCX均可参与对OCN的调控[56]。在成骨细胞中过表达Fra-2会导致OCN水平升高，同时模型小鼠出现体重减轻、血糖降低及糖耐量异常和靶器官胰岛素敏感性提高等病理生理改变，而敲除fra-2则表现出与之相反的状态[57]。GGCX能催化谷氨酸转化为γ-羧谷氨酸，在调节OCN生物利用度中起重要作用，如在成骨细胞中敲除ggcx可增加血清ucOCN水平，同时逆转糖耐量异常和脂肪堆积等症状[58-59]。

3.3 在生殖系统中的作用

Oury等[60]和Karsenty等[24]在针对ocn基因敲除小鼠的表型研究中发现，血清ucOCN含量与小鼠繁殖能力呈现正相关。与野生型小鼠相比，ocn基因缺失的小鼠繁殖能力较差，产崽数量明显减少。基于该结果提出假设，ucOCN可能通过影响类固醇性激素生成，进而调节生育能力。雌激素和睾酮对骨骼生长和维持有重要影响[61-62]，但关于从骨到性腺的“反向调节信号”此前并无报道。与该观点一致，成骨细胞的条件培养基以及外源ucOCN可增加睾丸间质细胞中睾酮生成，但对卵巢外植体产生的雌二醇或孕酮水平无影响。ocn基因敲除小鼠血清睾酮水平低，精子少，生殖器官重量减轻；而在体给予ucOCN可提升该雄性小鼠的生育能力。此外，在成骨细胞中增强胰岛素信号也可提高小鼠生育力，表明靶向成骨细胞中胰岛素信号调节雄性生育力的可能性。后续研究证实了该观点，即胰岛素通过刺激骨转换增加破骨细胞活性，介导OCN激活，继而促进雄性生育能力，形成“胰岛素-骨-性激素-骨”的反馈环路，OCN在该环路运转过程中发挥着多系统靶向调控作用[16]。

3.4 在神经系统中的作用

近年来OCN信号通路对脑功能的调控作用备受关注。ocn全基因敲除小鼠表现出明显认知行为缺陷，ocn缺失小鼠的认知能力受损，与焦虑和抑郁情绪相关的异常行为表现更明显[25，63-64]。有研究推测OCN在大脑可能作为一种神经肽发挥作用[64]，但在脑局部表达的OCN的作用并未得到进一步证实。Khrimian等[11]研究表明，外周ucOCN可穿过血脑屏障，作用于脑干、中脑和海马，影响与学习记忆形成密切相关的神经递质合成。OCN可促进单胺类神经递质合成相关基因的表达，抑制γ-氨基丁酸合成所需的基因，还与脑内5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素和γ-氨基丁酸的变化相关。更值得关注的是，母体胎盘来源的ucOCN似乎是胎儿大脑正常发育所必需的，在骨发育过程启动之前就能够在胎儿血液中检测到ucOCN，而ocn缺失的母体所生幼崽则出现脑内海马神经细胞凋亡增加等神经系统异常改变[25]。Hou等[65]在帕金森病（Parkinson disease，PD）小鼠模型中证实，OCN能够改善多巴胺能神经元的功能，逆转PD小鼠的异常行为，但该干预效应并非直接作用，而是通过改善肠道菌群实现。

另有一项新的研究结果表明，小鼠脑内海马颗粒区神经元高表达OCN，可通过分泌脑源性神经营养因子改善小鼠的认知行为[66]。海马颗粒区神经元在胚胎时期即能表达OCN。应用不同的技术方法分别标记处理人胚胎时期发育来的富含OCN的颗粒区细胞以及小鼠后天生发的颗粒区富含OCN的细胞。结果显示，胚胎时期发生而非后天产生的富含OCN的颗粒细胞群在小鼠出生后海马颗粒区神经发生以及认知功能调控中起到重要作用，提示组织器官局部表达的OCN也可能发挥与骨源性OCN相似的作用。此外，脑组织局部表达的OCN和骨源性OCN是否存在空间和时间上的效应关系也是一个值得关注的问题。

3.5 在运动系统中的作用

OCN参与调控的脂肪代谢、雄性生殖以及认知能力等生理功能均具有随年龄增加而进行性下降的共同特征。骨骼和肌肉作为运动系统2种重要的组织，具有相似的生物物理特性和机械感知能力，同时，肌肉运动能力减低与骨量下降明显相关。此外，运动能力亦随着年龄变化而衰减，Mera等[67]据此推测，OCN可能作为关键分子，参与调节肌肉减少和运动能力下降等衰老相关生理病理过程。随后研究亦证实，OCN可抵抗老年性肌肉减少，并通过特异性受体以非胰岛素依赖的方式促进肌肉能量代谢，增加肌肉的运动适应能力。与此同时，OCN还可促进白细胞介素6（interlukin-6，IL-6）分泌[20]，后者可进一步促进骨基质降解、释放更多ucOCN入血，维持肌肉的运动适应能力，形成骨-肌肉间的“闭合交互通路”[48]。最近有国内学者研究报道，黄精多糖可通过调节OCN信号增加机体抗疲劳性[68]，这与Mera等[67]的研究结论一致。

此外，OCN可作为肌腱母细胞的标志物，富含OCN的肌腱母细胞能够促进肌腱的再生修复[69]。在软骨细胞中过表达OCN可促进3D培养的软骨细胞钙结节形成，同时激活低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）通路，促进糖代谢[56]。在利用过表达OCN分子分析其对软骨细胞的影响时，若未将细胞中的OCN和具有激素活性的ucOCN区分开，或许会导致研究结果的偏倚。例如，既往文献报道HIF-1α通路对软骨的分化、成熟和表型的维持均是有利的[70-71]，这显然与OCN过表达后软骨细胞钙化钙结节形成增加的结论相矛盾。将ucOCN与细胞内OCN功能分开研究能够更好地解释上述分歧：过表达OCN的软骨细胞分泌至培养液中的ucOCN也会相应增多，尽管ucOCN激活HIF-1α对软骨表型维持有积极作用，但仍难以抵消细胞内过多OCN沉积而产生的矿化作用，由此造成了OCN诱导HIF-1α表达，仍出现软骨钙结节数目增多和骨化增强的现象。另外，在运动系统中，除骨细胞能产生OCN外，肌腱母细胞中也可检测出OCN，这些原位细胞内源性表达的OCN和骨源性激素类OCN的作用有何不同及是否有作用上的空间效应关系，依然是一个值得探讨的问题。

3.6 在应激反应中的作用

为探索OCN与运动适应的相关性，Mera等[67]研究发现，小鼠运动启动的最初阶段循环ucOCN增加最为明显，由此推测OCN可在“战斗或逃跑”应激反应（fight-or-flight response）中发挥积极作用[72]。相关实验研究证实了他们的推测，将小鼠暴露在几个不同的压力源下2～3 min，循环OCN水平可瞬间升高至对照组4倍以上；当研究人员要求志愿者在观众面前讲话时，血液中OCN水平也会迅速提升；同时OCN能够触发战斗或逃跑模式中脉搏加快、呼吸加重和血糖急剧升高等典型生理反应[72]。他们进一步揭示了OCN增强应激反应的机制。当大脑杏仁核检测到危险时，立即“指示”成骨细胞吸收神经元释放的谷氨酸，合成OCN并释放到血循环中，OCN可通过抑制副交感神经传导，解除其对交感神经系统的抑制，从而提高机体战斗或逃跑等应激反应能力。值得注意的是，最近有文献报道，应激条件可诱导IL-6通过“大脑-棕色脂肪-肝轴”触发应激反应[73]。鉴于OCN在多种组织中与IL-6的密切联系，在应激反应中是否介导跨系统之间功能协同或整合尚待深入研究。

4 结语

OCN对特定组织器官以及整个机体具有内分泌调节功能。此前，关于“骨主要是一种激素反应性组织”的观点现在应该被“骨作为一种内分泌器官”的新共识所取代。显然，OCN被视为一种骨内分泌因子，通过骨与胰腺、大脑和睾丸等组织器官之间的内分泌循环影响葡萄糖代谢、生殖发育和认知功能。最近又将OCN与衰老相关疾病、运动和应激联系起来。OCN与糖代谢异常疾病的相关性以及OCN可显著改善老年性生理功能障碍的特性或许能为一些疾病的诊断、治疗以及预后评估提供新的方法。例如，随年龄增长血液ucOCN水平明显下降，血液中加入重组ucOCN或在老年小鼠体内注入成年小鼠富含ucOCN的血浆可改善老年鼠肌肉量、运动能力和认知功能[20，25，67]；糖皮质激素治疗患者血清OCN水平降低可能与糖尿病相关[49]。此外，运动可显著增加循环OCN的水平，这有助于解析运动可延缓机体衰老的机制[74]。

随着骨骼对机体多器官功能的调控作用不断被揭示，笔者提出如下思考：①除分泌OCN外，骨是否还通过其他骨源性内分泌因子参与全身稳态的调控。②近期研究表明，OCN在一些骨外器官如脑中同样具有内源性表达，在认知调控的过程中脑局部的OCN发挥怎样的作用，是否与骨源OCN有一定的协同或时空次序效应。③ucOCN在肌肉、骨骼、脂肪组织和肌腱再生中均扮演重要角色，而软骨作为“骨骼-肌肉单位（bone-muscle unit）”整体的一部分，ucOCN在软骨中是否也发挥保护作用，其在“骨骼-肌肉单位”整合及各成员串扰中扮演着怎样的角色。④OCN对机体跨系统的调控作用是否存在空间和时间的联系和交互。尽管目前少量临床研究揭示了代谢紊乱与循环OCN之间的联系，但尚未证实二者之间存在确定的因果关系；在动物模型中观察到OCN所发挥的激素样功能以及多元性靶向调控机制仍有待于在人体相关基础与临床研究中予以证实，上述领域将是后续研究的重点方向。相信随着研究探索的持续深入，必将不断丰富对骨作为内分泌器官及OCN对机体发挥多元化靶向调控的全面了解，并为相关疾病的诊疗提供一个系统观的策略。