分级醇沉紫薯多糖抗氧化活性与稳定性

林 军 李高阳 黄 帆 谢秋涛 袁洪燕

(1. 湖南大学隆平分院，湖南 长沙 410125；2. 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；3. 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125；4. 湖南省果蔬加工与质量安全国际科技创新合作基地，湖南 长沙 410125)

紫薯，又名紫甘薯，因其花青素含量高而呈紫色[1]，除花青素外，紫薯中多糖含量较高，据相关研究[2]报道，紫薯中含有约5.42%的多糖，与鹰嘴豆粉多糖的含量(5.56%)接近。多糖具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗炎和增殖双歧杆菌[3-6]等作用，研究[7-8]表明，对植物多糖进行分级醇沉，可以达到一定的分离纯化效果，且有利于多糖的进一步开发利用。同时，植物多糖作为一种纯天然的抗氧化剂，可捕捉油脂氧化反应中产生的活性氧，从而对油脂起到一定的抗氧化效果。近年来，关于紫薯多糖的抗氧化作用，集中在其对自由基清除效果的研究上，而对油脂的抗氧化作用还少有相关研究报道，也未见采用分级醇沉方法对紫薯多糖进行分离纯化的相关报道。

研究拟采用40%，60%，80% 3个梯度的乙醇对紫薯多糖进行分级醇沉，并测定3种不同醇沉组分的组成、抗氧化活性以及其化学稳定性，从而筛选出抗氧化活性及稳定性较好的醇沉组分，以期为紫薯多糖的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

紫薯：紫罗兰，湖南市售；

Tris-HCl缓冲液：雷根生物技术有限公司；

DPPH：纯度≥97.0%，上海化成工业发展有限公司；

ABTS：纯度≥98.0%，上海瑞永生物科技有限公司；

某品牌菜籽油：湖南岳阳；

无水乙醇：分析纯，郑州派尼化学试剂厂；

果胶酶：酶活≥500 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

过硫酸钾、抗坏血酸、考马斯亮蓝、葡萄糖醛酸、咔唑、邻苯三酚、水杨酸：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；

明胶、硫酸钾、葡萄糖、三氯乙酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

氯化钡、硫酸亚铁：分析纯，西陇科学股份有限公司；

所有用水为超纯水。

1.1.2 主要仪器设备

紫外—可见分光光度计：UV-1800型，岛津仪器(苏州)有限公司；

高速离心机：vanfiJ-26xp型，美国Beckman公司；

数控超声波清洗器：KQ-700DE型，昆山市超声仪器有限公司；

精密分析天平：BSA124S型，广州市授科仪器科技有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9O53A型，上海精宏实验设备有限公司；

电热恒温水浴锅：XMTD-702型，北京三二八科学仪器有限公司；

多功能粉碎机：RS-FS1401型，合肥荣事达小家电有限公司；

旋转蒸发仪：GG17型，上海申顺生物科技有限公司；

冷冻干燥机：LGJ-25C型，四环福瑞科仪科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫薯多糖提取 根据文献[9]修改如下：采用果胶酶提法提取紫薯多糖，以蒸馏水为提取溶剂，提取条件为提取温度50 ℃、酶添加量2.5%、pH 3.5、酶解时间180 min、料液比(m紫薯粉∶V蒸馏水)1∶35(g/mL)，经5 300 r/min 离心20 min，收集上清液；沉淀重复提取1次，合并上清液，经旋转蒸发仪浓缩之后，在溶液中加入一定量无水乙醇，使乙醇体积分数达到80%，于4 ℃冰箱中醇沉过夜，经5 300 r/min离心20 min，收集沉淀冻干，得紫薯粗多糖，真空包装后，置于干燥器中在室温下贮存备用。

1.2.2 不同浓度乙醇沉淀多糖 根据文献[10]修改如下：将得到的紫薯粗多糖配制成10%的多糖溶液，离心去除不溶性杂质，在溶液中加入无水乙醇使乙醇体积分数达到40%，于4 ℃冰箱中醇沉过夜，离心分离收集多糖获得40%醇沉组分(PPSP-40%)。在上清液中再加入一定量无水乙醇，使乙醇体积分数达到60%(PPSP-60%)，醇沉过夜，收集多糖获得60%醇沉组分。按同样的方法，获得80%醇沉组分(PPSP-80%)。

1.2.3 多糖含量测定 根据文献[11]。

1.2.4 蛋白含量测定 根据文献[12]。

1.2.5 糖醛酸含量测定 根据文献[13]修改如下：吸取1.0 mL多糖溶液于试管中，加入5 mL浓硫酸，85 ℃水浴加热20 min，室温下冷却加入1.0 mL咔唑(1.5 mg/mL)，摇晃均匀，室温下反应2 h，于530 nm处测吸光值。

1.2.6 硫酸基含量测定 根据文献[14]。

1.2.7 醇沉多糖抗氧化活性研究

(1)DPPH自由基清除能力：根据文献[15]。

(2)ABTS自由基清除能力：根据文献[16]修改如下：取0.8 mL用乙醇稀释过的样品溶液与7.2 mL的ABTS工作液混合均匀，静置6 min后，于734 nm处测定其吸光值，根据吸光值计算ABTS自由基清除率。

(3)羟基自由基清除能力：根据文献[17]修改如下：取25 mL洁净试管，分别加入5 mL硫酸亚铁溶液(1 mmol/L)、5 mL过氧化氢溶液(3 mmol/L)，再加入1 mL样品溶液，空白管加入1 mL蒸馏水，混合均匀后用3 mmol/L的水杨酸溶液定容至25 mL，37 ℃水浴反应15 min，在510 nm处测定吸光值，按式(1)计算羟基自由基清除率。

(1)

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白溶液吸光值；

A1——样品溶液吸光值。

(4)超氧阴离子自由基清除能力：根据文献[18]。

(5)对菜籽油的抗氧化作用：根据文献[19-20]修改如下：准确称取30.0 g菜籽油，置于250 mL锥形瓶中，分别加入含量为0.01%，0.02%，0.04%的醇沉组分；以不添加任何物质的菜籽油为空白对照；以添加0.04%抗坏血酸的菜籽油为阳性对照，同时做平行试样。将全部样品混合均匀后置于60 ℃恒温干燥箱中强化贮存，定时振荡混匀并改变样品在干燥箱中的相对位置，每隔2 d取样，按照GB/T 5009.37—2003中的方法测定氢过氧化物含量和丙二醛含量。

(6)稳定性试验：根据文献[9]修改如下：

高温稳定性试验：① 量取1.00 mL多糖溶液样品，加入4.00 mL超纯水；② 量取1.00 mL多糖溶液样品，加入4.00 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液；③ 量取1.00 mL多糖溶液样品，加入4.00 mL 4 mol/L氢氧化钠溶液。将上述3种溶液于121 ℃高温处理20 min后，中和②号和③号样品至中性，并将3种样品定容至10.00 mL，测定粗多糖含量。

酸稳定性试验：量取1.00 mL多糖溶液样品，加入4.00 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液于60 ℃保温6 h，冷却后用氢氧化钠溶液中和至中性，定容至10.00 mL，测定粗多糖含量。

碱稳定性试验：量取1.00 mL多糖溶液样品，加入4.00 mL 4 mol/L氢氧化钠溶液于60 ℃保温6 h，冷却后用三氟乙酸溶液中和至中性，定容至10.00 mL，测定粗多糖含量。

对照样品多糖含量测定：量取1.00 mL多糖溶液样品，不进行任何处理，直接用水定容至10.00 mL，测定粗多糖含量。

1.3 数据处理

采用Origin 2019对试验结果进行作图分析，采用SPSS 26统计学软件进行数据统计分析。P<0.05时有显著性差异，P<0.01时有极显著差异。

2 结果与讨论

2.1 紫薯多糖各物质含量

由表1可以看出，3种醇沉组分总质量占比为82.96%，得率较高，其中mPPSP-40%∶mPPSP-60%∶mPPSP-80%=17.33∶27.16∶38.47。当乙醇体积分数为80%时，多糖含量较高。当乙醇体积分数为40%时，多糖含量较低，3种组分的多糖含量随乙醇体积分数的升高而增加，与田冰梅等[21]对宣木瓜多糖进行分级醇沉所得的结果相似，一般来说，小分子的多糖极性更高，需要更高浓度的乙醇才能沉淀下来，因此PPSP-80%中的多糖种类可能更多，多糖含量更高；并且PPSP-80%的蛋白质、葡萄糖醛酸和硫酸基含量也最高，其次为PPSP-60%，而PPSP-40%所得的含量最低。以多糖含量为参考指标，乙醇体积分数选择80%为宜。

表1 分级醇沉紫薯多糖各组分物质含量†Table 1 Gradient alcohol-sinking purple potato polysaccharide components of the substance content g/100 g

2.2 紫薯多糖清除DPPH自由基能力

由表2和图1可知，PPSP-40%、PPSP-60%、PPSP-80% 3种醇沉组分对DPPH自由基都具有一定的清除能力，其IC50值大小顺序为：PPSP-40%>PPSP-60%>PPSP-80%，说明PPSP-80%对DPPH自由基清除能力最强，PPSP-60%次之，清除能力最弱的为PPSP-40%，但3种醇沉组分清除DPPH自由基的能力与维生素C相比还有差距。当质量浓度升高时，各醇沉组分对自由基的清除率也逐渐上升，质量浓度达到0.8 mg/mL时，PPSP-60%和PPSP-80%对自由基的清除增长率明显降低，而PPSP-40%对自由基的清除增长率无明显变化，说明要达到较好的清除效果，需要更高浓度的PPSP-40%，且各组分对DPPH自由基的清除能力呈量效关系。

图1 紫薯多糖对DPPH自由基的清除能力Figure 1 Purple potato polysaccharides on DPPH free radical removal capacity

2.3 紫薯多糖清除ABTS自由基能力

由图2可知，当PPSP-40%和PPSP-60%两种醇沉组分浓度较低时，对ABTS自由基的清除能力接近，当浓度升高时，PPSP-60%的清除能力优于PPSP-40%，但均不及PPSP-80%和维生素C，浓度较低时，PPSP-80%对自由基的清除能力与维生素C相比差距较大，但随着浓度的增加，PPSP-80%的清除能力逐渐与维生素C持平，说明要达到较好的清除效果，需要的样品浓度比较大。由表2可知，PPSP-40%的IC50值最大，为1.233 mg/mL，其次为PPSP-60%，而PPSP-80%的IC50值相对较小，为0.343 mg/mL，说明PPSP-80%对ABTS自由基的清除能力最强，PPSP-60%次之，PPSP-40%清除能力最弱。

表2 分级醇沉紫薯多糖及维生素C抗氧化活性IC50值†Table 2 Gradient alcohol-sinking purple potato polysaccharide antioxidant activity IC50 value

图2 紫薯多糖对ABTS自由基的清除能力Figure 2 Purple potato polysaccharides on ABTS free radical removal capacity

2.4 紫薯多糖清除羟基自由基能力

由图3可知，3种醇沉组分对羟基自由基都具有一定的清除能力，PPSP-40%对羟基自由基的清除能力最弱，PPSP-80%次之，PPSP-60%清除能力最强，且这两种醇沉组分的清除能力接近，在质量浓度为1.0 mg/mL时，PPSP-60%的清除能力稍强于维生素C，清除能力随浓度的增加而增强。由表2可知，PPSP-60%的IC50值最小，为0.318 mg/mL，PPSP-80%的IC50值为0.353 mg/mL，两种醇沉组分之间的IC50值无显著性差异，而PPSP-40%的IC50值最大，为0.985 mg/mL，说明其对羟基自由基的清除能力最弱。

图3 紫薯多糖对羟基自由基的清除能力Figure 3 Purple potato polysaccharide hydroxyl free radical removal capacity

2.5 紫薯多糖清除超氧阴离子自由基能力

由图4可知，采用不同浓度的醇沉组分进行超氧阴离子自由基清除试验，随着醇沉组分质量浓度的升高，对自由基的清除效果也越好，在质量浓度较低时，PPSP-60%的清除效果强于PPSP-40%，当质量浓度达到1 mg/mL时，PPSP-40%的清除效果稍强于PPSP-60%，但均不及PPSP-80%和维生素C。由表2可知，PPSP-80%的IC50值最小，为0.321 mg/mL，说明其对超氧阴离子自由基的清除效果最好，PPSP-60%的IC50值为0.848 mg/mL，PPSP-40%的IC50值最大，为0.916 mg/mL，说明其对超氧阴离子自由基的清除能力最弱。

图4 紫薯多糖对超氧阴离子自由基的清除能力Figure 4 Purple potato polysaccharides on superoxy anion free radical removal capacity

与紫薯中其他活性物质相比，3种醇沉组分对DPPH自由基清除能力均不如紫薯茎叶中的黄酮类化合物[22]，但PPSP-80%对自由基的清除能力与紫薯花色苷接近，而花色苷具有很强的抗氧化活性[23]，说明PPSP-80%的抗氧化能力较强。

2.6 对菜籽油的抗氧化效果

由图5可知，随着试验时长的增加，菜籽油氢过氧化物和丙二醛含量都呈升高的趋势，与空白菜籽油相比，添加PPSP-40%可以降低其氢过氧化物和丙二醛含量，并且随着PPSP-40%添加量的增加，降低的幅度也越大，在试验时间为14 d时，空白菜籽油的氢过氧化物和丙二醛含量分别为55.78 mg/kg和111.11 mg/kg，而PPSP-40%添加量为0.01%，0.02%，0.04%时，菜籽油的氢过氧化物含量分别达到52.15，49.91，43.34 meq/kg，而丙二醛含量分别达到97.98，84.60，78.03 mg/kg。说明不同添加量的PPSP-40%都可以提高菜籽油的抗氧化能力，并且随着多糖添加量的增加，抗氧化效果更好。当试验时间为16 d时，空白菜籽油的氢过氧化物和丙二醛含量分别为64.06 meq/kg 和124.09 mg/kg，而PPSP-40%添加量为0.01%时，菜籽油的氢过氧化物和丙二醛含量分别达到61.90 meq/kg和115.81 mg/kg，其氢过氧化物含量稍高于空白组，但两者并无显著性差异，可能是因为所添加的样品含量有限，随着试验时间的延长，抗氧化剂被消耗完全，导致菜籽油的氧化速率加快，但添加量为0.02%和0.04% 的试验组仍具备抗氧化效果，因此，PPSP-40%要对菜籽油达到较好的抗氧化效果，需要增加其添加量，其抗氧化效果呈剂量—效应关系。

小写字母不同表示在相同时间不同处理间差异达到显著水平(P<0.05)图5 PPSP-40%对菜籽油的抗氧化作用Figure 5 PPSP-40% antioxidant effect on rapeseed oil

如图6可知，PPSP-60%对菜籽油具有一定的抗氧化效果，且抗氧化的效果随其添加量的增多而增强，0.04%添加量的菜籽油抗氧化效果最好，试验2 d时，空白菜籽油的氢过氧化物和丙二醛含量分别为1.72 meq/kg和15.69 mg/kg，而PPSP-60%添加量为0.01%，0.02%，0.04%时，菜籽油的氢过氧化物含量分别达到1.75，1.36，1.24 meq/kg，而丙二醛含量分别达到12.86，11.46，10.90 mg/kg，表明在试验初期，PPSP-60%就具有增强菜籽油抗氧化效果的作用，但各处理组氢过氧化物和丙二醛的含量差值并不大，可能是油脂贮藏初期氧化速率还比较慢，试验16 d时，空白组的氢过氧化物含量增加至64.06 meq/kg，而PPSP-60%添加量为0.01%，0.02%，0.04%的处理组分别为59.91，56.77，55.29 meq/kg，结果表明添加的PPSP-60%越多，氢过氧化物和丙二醛含量越低。证明PPSP-60%对菜籽油具有一定的抗氧化效果。

小写字母不同表示在相同时间不同处理间差异达到显著水平(P<0.05)图6 PPSP-60%对菜籽油的抗氧化作用Figure 6 PPSP-60% antioxidant effect on rapeseed oil

由图7可知，0.02% PPSP-80%对菜籽油的抗氧化效果与维生素C相当，添加0.04% PPSP-80%的抗氧化效果最好，0.01% PPSP-80%效果最差，表现出剂量效应，在试验4 d时，空白对照组氢过氧化物和丙二醛含量分别为4.65 meq/kg 和29.12 mg/kg，而添加0.02% PPSP-80%试验组氢过氧化物和丙二醛含量分别为3.22 meq/kg和19.24 mg/kg，维生素C阳性对照组氢过氧化物和丙二醛含量分别为2.05 meq/kg和15.06 mg/kg，表明二者对菜籽油均具有抗氧化效果，且维生素C的抗氧化效果要稍好于0.02% PPSP-80%，但随着试验时间的延长，在试验2～12 d时，维生素C的效果比0.02% PPSP-80%要好，在试验12～16 d时，维生素C的抗氧化效果不如0.02% PPSP-80%，可能是维生素C作为天然的抗氧化剂，其化学性质极其不稳定，在试验过程中容易分解，从而导致抗氧化效果降低，而多糖具有更高的稳定性，长期贮藏对菜籽油的抗氧化效果要优于维生素C。

小写字母不同表示在相同时间不同处理间差异达到显著水平(P<0.05)图7 PPSP-80%对菜籽油的抗氧化作用Figure 7 PPSP-80% antioxidant effect on rapeseed oil

由图5～图7可知，与空白菜籽油相比，PPSP-40%、PPSP-60%和PPSP-80% 3种醇沉组分对菜籽油均具有一定的抗氧化效果，可降低菜籽油的氢过氧化物和丙二醛含量，且抗氧化效果都随添加量的增加而逐渐增强，3种醇沉组分对菜籽油的抗氧化作用存在差异，且在添加量为0.01%时，PPSP-80%对菜籽油的抗氧化效果最好，PPSP-60%抗氧化效果次之，PPSP-40%抗氧化效果最差，但抗氧化的效果与空白对照组相比并不明显，可能是因为醇沉组分添加量较少所致；当多糖添加量为0.02%，随着多糖添加量的增加，在试验初期对菜籽油已经具备明显的抗氧化效果；当多糖添加量达到0.04%时，添加PPSP-40%和添加PPSP-60%的菜籽油氢过氧化物含量相近，但二者的丙二醛含量仍然存在差异，试验16 d时，分别为88.16，75.40 mg/kg，可能是在试验后期，菜籽油以二次氧化为主，产生大量的丙二醛，而不同醇沉组分的抗氧化能力不同，抗氧化能力最差的为PPSP-40%，在试验后期抗氧化能力逐渐减弱，对丙二醛的清除能力有限，而PPSP-60%可能仍然具备一定的抗氧化能力，因此各试验组之间丙二醛含量差值较大。试验结果表明，各醇沉组分对菜籽油的抗氧化效果呈剂量效应，且PPSP-80%效果最好，PPSP-60%次之，PPSP-40%效果最差，可能是因为乙醇浓度越高，所沉淀出的组分分子量越小，而多糖发挥生理活性需要将其分子量控制在一定范围内[7]，PPSP-80%中可能含有许多抗氧化性能较好的小分子组分，因此抗氧化活性最强,可以成为很好的油脂纯天然抗氧化剂。目前，许多植物多糖，如油樟叶多糖[24]也对菜籽油具有一定的抗氧化效果，且BHT对其有一定的协同增效作用，3种醇沉组分与油樟叶多糖都能降低菜籽油中的氢过氧化物含量，作用的原理相似，但其他抗氧化剂对醇沉组分抗氧化效果的协同作用还有待进一步研究。

2.7 紫薯多糖化学稳定性

由表3可知，PPSP-40%的稳定性最差，相对于未处理的对照样品，稳定性都在50%以下，其中，在极端碱性和高温条件下，稳定性最差；PPSP-60%的稳定性较好，各种环境下稳定率均可达50%以上，在极端碱性条件下稳定性最好，为84.12%，但随着温度逐渐升高，PPSP-60%的化学稳定性逐渐下降，在极端碱性和高温条件下，稳定率下降至52.58%；而PPSP-80%在121 ℃高温条件下稳定性最好，为97.65%，而在其他条件下稳定率都低于50%，说明PPSP-80%在酸性和碱性条件下都不稳定。结果表明在PPSP-80%可以在高温条件下稳定贮藏，但在加工利用中要严格把控环境的pH，而PPSP-60%在碱性条件下的比较稳定，但在高温下容易发生变性，因此要注意环境的温度，而PPSP-40%在酸性、碱性及高温条件下稳定性都较差，对贮藏和加工的条件要求比较高。

表3 3种醇沉组分化学稳定性结果Table 3 The chemical stability results of the three alcohol sink components

3 结论

通过对紫薯粗多糖进行分级醇沉，得到3种醇沉组分(PPSP-40%、PPSP-60%、PPSP-80%)，3种醇沉组分对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基都具有一定的清除能力，但清除效果都不及维生素C。其中，PPSP-80%对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基清除能力最强，PPSP-60%对羟基自由基清除能力最强，而PPSP-40%的清除能力最差。3种醇沉组分对菜籽油也具有一定的抗氧化效果，并且随着醇沉组分添加量的增加，对菜籽油的抗氧化效果越好，对菜籽油抗氧化效果最好的是PPSP-80%，其次为PPSP-60%，效果最差的为PPSP-40%，且抗氧化效果呈剂量效应。通过稳定性试验，结果表明PPSP-40%的稳定性最差，PPSP-60%在极端碱性条件(4 mol/L氢氧化钠溶液)下稳定性最好，而PPSP-80%在121 ℃高温条件下稳定性最好。

紫薯多糖不同醇沉组分都具有一定的抗氧化效果，且不同组分抗氧化效果和化学稳定性具有明显差异，但抗氧化效果主要是通过体外抗氧化试验来对比研究，后续将对紫薯多糖的体内抗氧化效果进行进一步的研究与分析。