电喷雾串联质谱法鉴定甜叶菊干叶中甜菊糖苷的结构

吕博，韩印森，许庆轩，2，3

（1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2.农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨 150080；3.农业农村部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨 150080)

0 引言

近年来，为了替代蔗糖，减轻健康方面的顾虑，人们对高效甜味剂的需求日益增加。甜叶菊是一种菊科多年生草本植物，原产于南美洲，其中的甜菊糖苷（Steviol glycosides）是一类四环二萜类糖苷物质，具有低热量、高甜度且无毒副作用，是目前正在研究作为蔗糖替代品的一种天然物质[1-2]，甜度是蔗糖的50～300倍，这主要得益于甜叶菊叶片中的多种甜菊糖苷成分[3]，此外，甜叶菊中的活性成分黄酮[4-5]、多酚类成分[6-8]抗氧化能力强，其他成分还主要包括生物碱、甾醇、多糖、脂肪酸、氨基酸、嘌呤等。值得一提的是，甜叶菊叶片脂肪酸中棕榈酸含量很高，占总脂肪酸的80%以上[9]。

甜叶菊由于产地不同所含的甜菊糖苷种类有很大差异，其次甜菊糖苷种类很多，把这些甜菊糖苷一一鉴定出来并不容易，并且有些含量少的糖苷按照传统方法很难确定结构，急需一种方法简单快速地鉴定出其中的糖苷类成分。质谱法具有很高的灵敏性、特异性，且响应速度快，是目前应用范围广泛的分析测试技术之一。电喷雾串联质谱（ESI-MS/MS）能够进行多级质谱的结构解析，不需要复杂的样品前处理，就可以在复杂混合物中快速找出其中糖苷成分，串联质谱可以给出丰富的结构信息，通过这些结构信息能够快速确定这些糖苷结构，图1 为甜菊糖苷化学结构通式，表1 为在此基础上的几种甜菊糖苷类成分的结构。ESI-MS 中形成的离子主要是准分子离子，如[M+H]+、[M-H]-等。准分子离子峰经过低能量的碰撞诱导解离（CID），碎裂一般遵循“偶电子规则”，即产生偶电子碎片离子和中性分子。对碎裂机理进行研究有助于推导未知化合物的结构。本工作采用电喷雾串联质谱对甜叶菊中甜菊糖苷进行串联质谱分析，并研究此类化合物多级质谱裂解途径，为甜菊糖苷及其衍生物的结构修饰与代谢反应的研究提供极有价值的信息。

图1 甜菊糖苷的化学结构Fig.1 Chemical structures of the steviol glycosides

表1 几种甜菊糖苷的化学结构Table 1 Chemical structures of the steviol glycosides

1 材料与方法

1.1 主要仪器与装置

LCQ Fleet 离子阱质谱仪（包括Caliber 工作站,美国赛默飞世尔公司）；移液器（美国赛默飞世尔公司）；Mille-Q 超纯水机（美国Millipore公司）；电子天平（日本岛津公司）；KQ-250DB型超声清洗器（昆山市超声仪器公司）；流动注射泵（美国KD Scientific）。

1.2 主要材料与试剂

甜叶菊：安徽省太和县新源保健茶厂；甲醇：色谱纯，天津富宇精细化工有限公司产品。

1.3 试验条件

1.3.1 样品处理

将甜叶菊干叶粉碎后得到甜叶菊粉末。称取0.5 g 甜叶菊粉末于100 mL 烧杯中，加入25 mL 60%甲醇摇匀后水浴超声处理30 min，得到的甜叶菊苷粗提液与甲醇1∶4混匀，过0.22µm有机相滤膜备用。

称取0.5 g甜叶菊粉末、0.05 g NaCl于100 mL烧杯中，加入25 mL蒸馏水摇匀后水浴超声处理30 min，得到的甜叶菊苷粗提液稀释在甲醇：水为1∶1 的溶液中至甜叶菊浓度为1 mg/L，此时水提液中NaCl 浓度刚好为0.1 mg/L，过0.22µm 有机相滤膜备用。

1.3.2 质谱条件

电喷雾（ESI）离子源；喷雾电压±4 000 V；离子源温度275 ℃；毛细管电压26 V；采用全扫描模式（SCAN）；质量扫描范围m/z 200～1 200；质谱进样速度为10µL/min。

2 结果与讨论

2.1 甜叶菊干叶提取液的电喷雾全扫描分析

图2 是甜叶菊干叶提取液的正离子电喷雾全扫描图。由于甜菊糖苷的多羟基结构，在电喷雾正离子模式下容易形成加氢离子、加钠离子和加钾离子等多种准分子离子。各化合物中加钠离子质量数比加氢离子多22，加钾离子质量数比加钠离子多16，根据这些差值可以确定这些化合物的质量数，同时与文献[10-13]对照可以初步确定这些化合物的身份，比如：m/z643为RB/SB加H 峰，m/z665 为RB/SB加Na峰，m/z681为RB/SB加K 峰；m/z789 为DA 加H 峰，m/z811 为DA 加Na 峰，m/z827 为DA 加K 峰或STV/RB加Na 峰，m/z843 为STV/RB 加K 峰；m/z951 为RC 加H 峰，m/z973 为RC 加Na 峰，m/z989 为RC 加Na 峰或RA/RE 加Na 峰，m/z967 为RA/RE 加H 峰，m/z1005 为RA/RE 加K 峰。只有甜叶菊成分中的甜菊糖苷具有这种特征，可以快速地把甜菊糖苷与其它成分区别出来。

图2 甜叶菊干叶提取液的正离子电喷雾全扫描图Fig.2 Full scan mass spectrum of stevia dried leaves extract in positive ion mode

由于正离子模式下甜菊糖苷信号比较弱，难以进行串联质谱研究，但是由于其丰富的加和离子信息，可以初步确定甜菊糖苷的身份，使其在结构鉴定中仍然具有重要的价值。

根据甜叶菊干叶提取液的负离子电喷雾全扫描图（图3）和几种已知甜菊糖苷的相对分子质量（表2）可知，谱图中出现的m/z641、803、965是几种甜菊糖苷减H 峰，m/z677、839、985、1 001是甜菊糖苷加Cl峰（见表2），减H 峰与加Cl 峰相对分子量相差36，此为甜菊糖苷类成分的特征峰，可以用于鉴定甜菊糖苷。另外m/z353、447、515 几种丰度较强的峰分别为甜叶菊叶中的酚类成分咖啡酰奎宁酸、阿魏酰奎尼酸、二咖啡酰奎宁酸[14-15]。在负离子模式下，甜菊糖苷的去质子化物质和氯离子加合物在整个质谱图中都可以观察到。在负离子模式下观察到的氯离子加合物可能是由质谱仪或叶基质中的痕量氯化物引起的。在图3 中，RS/SB减H峰信号强度明显高于加Cl峰，STV/RB加Cl峰信号强度是其减H峰的将近6倍，RA/RE加Cl峰信号强度是其减H 峰的4 倍左右。在样品中人为添加氯离子如图4 所示。RS/SB 减H 峰信号强度低于加Cl 峰，STV/RB 加Cl 峰信号强度是其减H 峰的8 倍，RA/RE加Cl峰信号强度是其减H 峰的4 倍左右。对比发现，结构中C19 位R1为H 的甜菊糖苷信号强度增强，C19位R1为糖基的甜菊糖苷信号强度无明显变化，说明结构中C19位R1为H的甜菊糖苷更容易受环境中Cl离子的影响，在谱图中表现为甜菊糖苷加Cl峰信号强度的提高。

图3 甜叶菊干叶提取液的负离子电喷雾全扫描图Fig.3 Full scan mass spectrum of stevia dried leaves extract in negative ion mode

图4 甜叶菊干叶提取液（0.1 mg/L的NaCl溶液）的负离子电喷雾全扫描图Fig.4 Full scan mass spectrum of stevia dried leaves extract(0.1 mg/L NaCl solution)in negative ion mode

表2 甜菊糖苷的质谱峰和相对分子质量Table 2 The mass spectra and relative molecular mass of steviol glycosides

2.2 负离子模式下甜菊糖苷的电喷雾串联质谱分析

负离子模式下相对分子质量为642的化合物的ESI-MS2质谱图示于图5a，m/z641在高能量（由于甜菊糖苷结构中电子云密度的影响，低能量下C19 位上的基团易断裂，只有在能量较高的状态下，结构中C13 位的基团才能断裂[16]）轰击下产生子离子m/z479、461、317。为了研究其电喷雾质谱碎裂规律，对准分子离子进行多级串连质谱研究。子离子m/z479 在能量轰击下碎裂成子离子m/z317 示于图5b中，子离子m/z461 在能量轰击下碎裂成子离子m/z317 示于图5c 中，m/z317 不再发生碎裂。m/z641 丢失一分子葡萄糖基得到子离子m/z479，丢失一分子葡萄糖基、一分子水或者一分子葡萄糖得到子离子m/z461。若丢失一分子葡萄糖，在下一次断裂时应该为葡萄糖基的断裂，然而子离子m/z461在能量轰击下碎裂成子离子m/z317 与假设不符，因此推测m/z641 在发生碎裂时丢失的为一分子葡萄糖基、一分子水，并且这种丢失水分子的情况概率低且信号强度很低，说明水分子的丢失并不容易。与甜茶苷、甜菊双糖苷的结构相对应。

图5 负离子模式下m/z641（a）、m/z479（b）、m/z461（c）的电喷雾串联质谱图Fig.5 ESI-MSn spectra of the ions at m/z641(a),m/z 479(b)and m/z 461(c)in negative ion mode

负离子模式下相对分子质量为788 的化合物的ESI-MS2质谱图示于图6a，m/z787 在能量轰击下产生子离子m/z641、625、607、479、317。为了探讨其电喷雾质谱碎裂规律，对准分子离子进行多级串连质谱研究。首先选择m/z641 子离子，该离子在能量轰击下产生子离子m/z479、461、317 示于图6b 中。其次选择子离子625，在能量轰击下，该子离子裂解为m/z479、461、317 示于图6c 中。子离子m/z479 在能量轰击下又可碎裂成子离子m/z317 示于图6d 中。m/z787 丢失一分子鼠李糖基得到子离子m/z641，丢失一分子葡萄糖基得到子离子m/z625，丢失一分子葡萄糖基、一分子水得到子离子m/z607，丢失一分子鼠李糖基、一分子葡萄糖基得到子离子m/z479，丢失一分子鼠李糖基、两分子葡萄糖基得到子离子m/z317。这与杜克苷A 的结构相对应。碎裂产生的子离子m/z625的信号强度最高，远远高于m/z641的信号强度，由此看出，杜克苷A发生碎裂时葡萄糖基相比鼠李糖基容易脱去，因此可以得出结论，甜菊糖苷离子的C19比C13位容易断裂。结合杜克苷A 的结构，其二级谱图中出现丢失水分子的峰，并且必定伴随C19 位葡萄糖基的丢失，推测丢失的水分子是在C13 位鼠李糖上。与相对分子质量为642 的化合物比较，其在二级谱图中出现的丢失水分子的结构应为C19位同样为葡萄糖基的甜茶苷，而甜菊双糖苷没有水分子的损失。

图6 负离子模式下m/z787（a）、m/z641（b）、m/z625（c）、m/z479（d）的电喷雾串联质谱图Fig.6 ESI-MSn spectra of the ions at m/z787(a),m/z641(b)and m/z625(c),m/z479(d)in negative ion mode

负离子模式下相对分子质量为803的化合物的ESI-MS2质谱图示于图7。[STV/RB-H]-串联质谱图示于图7a，m/z803在能量轰击下产生子离子m/z641、623、479、317；为了研究其电喷雾质谱碎裂规律，对准分子离子进行多级串连质谱研究。m/z803 的子离子峰m/z641在能量轰击下碎裂成子离子m/z479、461、317示于图7b 中，子离子m/z479 在能量轰击下碎裂成子离子317 示于图7c 中。[STV/RB+Cl]-串联质谱图示于图7d 中，m/z839的子离子峰在能量轰击下碎裂成子离子m/z803、641，其中子离子m/z641在能量轰击下碎裂成子离子m/z479、317示于图7e中，与m/z803的碎裂过程相同。m/z803丢失一分子葡萄糖基得到子离子m/z641，丢失一分子葡萄糖基、一分子水得到子离子m/z623，丢失两分子葡萄糖基得到子离子m/z479，丢失三分子葡萄糖基得到子离子m/z317。与甜菊苷、瑞鲍迪苷B的结构对应。碎裂过程中有水的损失，必定存在C19位葡萄糖基的成分，即STV。

图7 负离子模式下m/z803（a）、m/z641（b）、m/z479（c）、m/z839（d）、m/z641（e）的电喷雾串联质谱图Fig.7 ESI-MSnspecta of the ions at m/z803(a),m/z641(b),m/z479(c),m/z839(d),m/z641(e)in negative ion mode

负离子模式下相对分子质量为967 的化合物的ESI-MS2质谱图示于图8a，m/z1001 在15.5%能量轰击下产生子离子m/z965、803。为了研究其电喷雾质谱碎裂规律，对准分子离子进行多级串连质谱研究。子离子m/z803 在16%能量下碎裂成子离子m/z641、479、317 示于图8b 中。m/z1001 丢失一分子氯化氢得到子离子m/z965，丢失一分子氯化氢、一分子葡萄糖基得到子离子m/z803。与瑞鲍迪苷A的结构对应。

图8 负离子模式下m/z1001（a）、m/z803（b）的电喷雾串联质谱图Fig.8 ESI-MSn spectra of the ions at m/z1001(a)and m/z803(b)in negative ion mode

3 讨论与结论

对甜叶菊中的甜菊糖苷进行了电喷雾多级串联质谱分析研究，并在负离子模式下均获得了灵敏度较高的电喷雾质谱信息。在负离子模式下，各化合物在二级串联质谱中均发生在C13 位O-C键的断裂及C19位侧链羧基的断裂。这是该类化合物的质谱断裂特征，可能是由于C19位所连的羧基的诱导及吸电子特性，使其电子云发生偏移，致使O-C 键易于断裂造成的；C13 位亦然。ESI 作为一种软电离方式，以多级串联质谱（MS）分析甜菊糖苷的扫描质谱裂解规律，发现其基本裂解途径相似。本研究为甜菊糖苷及其衍生物的结构修饰与代谢反应的研究提供了极有价值的信息。

（1）甜叶菊干叶提取液的正离子电喷雾全扫描图信息丰富，可以根据[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+离子对相对分子质量分别相差22、16 对甜菊糖苷进行判断，即可以作为甜菊糖苷的特征峰；在甜叶菊干叶提取液的负离子电喷雾全扫描图中，可以根据[M-H]-、[M+Cl]-离子对相对分子质量相差36，其他成分不具有这种特性，因此可以作为甜菊糖苷的特征峰进行判断。

甜叶菊由于产地的不同含有的甜菊糖苷种类也不同，目前已发现30 多种甜菊糖苷[17]，因此甜菊糖苷的鉴定方法显得尤为重要。利用电喷雾正离子模式及负离子模式中的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[M-H]-、[M+Cl]-特征离子能够快速识别甜叶菊中的甜菊糖苷类成分，对甜菊糖苷的鉴定有重要意义。

（2）电喷雾串联质谱中，碰撞能量相同的条件下，甜菊糖苷结构中C19 位的糖苷键相较于C13 位糖苷键更易断裂；虽然甜菊糖苷结构中连接的糖基含有多个OH 活性基团，但即使在较高的碰撞能量下也不易断裂；所有甜菊糖苷最后都碎裂为m/z317 的子离子，说明在串联质谱中，甜菊糖苷只丢失C13、C19 位的取代基，骨架结构不发生碎裂，因此可以作为鉴定此类化合物的基础。

（3）液相色谱质谱联用（LC-MS）可实现对甜菊糖苷类成分同分异构体的分离及鉴定，但在进行电喷雾串联质谱时却缺乏灵活性，单独使用电喷雾质谱法可以灵活地选择目标离子、使用合适的碎裂能量进行多级串联质谱研究，更方便地获取目标化合物结构信息。