防治人参黑斑病与灰霉病的复合芽孢杆菌制剂1)

高媛 孟祥才 刘秀波 徐姣 马伟 赵春建

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(黑龙江中医药大学)(东北林业大学)

人参(PanaxginsengC. A. Meyer)栽培受到很多因素的制约，病害是其中最主要因素。人参病害以黑斑病、灰霉病、炭疽病、疫病等为常见的病害，且发生非常普遍。目前人参病害主要防治技术手段为化学防治，生长期一般7～10 d需要喷施1次化学农药，进行病害防治。然而，人参病原菌会对化学杀菌剂产生一定程度的抗药性[1]，且人工栽培的人参被遮阴棚所覆盖，叶片上的化学农药不能完全被雨水冲淋，残留在叶片之上，严重影响人参药材的质量。中药材农药残留问题一直是制约中药材产业发展的关键因素[2]，绿色生态农业中药是中药材产业发展的必由之路[3]。

人参病原菌在人参生长环境中广泛存在。植物发病的本质原因多是高温、高湿等环境变化导致菌落失衡，有益菌减少、病原菌增多。根据达尔文“物种竞争”理论，可通过人为施加有益菌，占领人参叶面的“空间”；或用益生菌拮抗病原菌；从而达到防病、治病的目的。近年来，芽孢杆菌作为一类优势菌种，成为生物防治领域关注度较高的研究对象。目前对枯草芽孢杆菌的应用研究相对较为成熟，已有大量试验结果[4-9]证明，枯草芽孢杆菌，对于枯萎病、软腐病、立枯病、根腐病、纹枯病、灰霉病、早疫病、青枯病等植物病害，均有较好的防治效果。特基拉芽孢杆菌，对稻瘟病的防治效果可达到防效范围55.71%～83.33%[10]，可以降低鳄梨的炭疽病严重程度(41.9%)[11]。贝莱斯芽孢杆菌，对花生白绢病的防治效果可达66.15%[12]，对番茄产后灰霉病的防治效果可达到73.47%[13]，成为最新发现的潜力生防菌之一。同样作为最新发现的潜力生防菌之一的地衣芽孢杆菌，对桃枝枯病菌具有明显的抑制作用[14]，对棉苗立枯病、炭疽病、红腐病的防治效果分别为60.42%、62.56%、41.47%[15]。已有研究证明，枯草芽孢杆菌对人参黑斑病及灰霉病均表现出良好的抑菌效率[16]，其他3种有潜力的生防菌还未被应用于人参病原菌的防治。

为此，本研究从2个不同的人参栽培基地选取健康无病变的人参植株叶片作为筛选生防菌的材料，应用选择性分离法从人参叶片中分离芽孢菌，经染色鉴定、菌落形态鉴定、显微形态鉴定及基因序列分析，筛选出286株芽孢菌，其中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)4种菌为优势菌种；制备复合芽孢杆菌制剂，4个菌种的菌株比例n(枯草芽孢杆菌)∶n(特基拉芽孢杆菌)∶n(贝莱斯芽孢杆菌)∶n(地衣芽孢杆菌)约为100∶60∶70∶40；分别用4种优势菌与复合芽孢杆菌做平板，进行对峙拮抗试验，分析4种优势菌与复合芽孢杆菌对人参黑斑病和灰霉病防治效果。本研究开发可用于防治人参黑斑病、灰霉病的高效复合菌剂，旨在为有效弥补单一菌剂防治效果易受到环境影响而不稳定的缺点、促进绿色人参中药材产业的发展。

1 材料和方法

人参叶片采于黑龙江省沾河林业局和庆安县，每产地在不同区域采集健康叶20余片。

1.1 人参叶片中芽孢菌的分离

在超净工作台内，将人参叶片用消毒剪刀剪切成边长为1～2 cm的方形碎片，放入装有50 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，120 r/min振荡1 h，置于保温箱中63 ℃保温处理4 h，杀灭非芽孢菌，无菌纱布滤除叶片后的悬液可得芽孢菌悬液，即待分离的样本。

制备灭菌综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基(CPDA)，倒入直径为9 cm的灭菌培养皿制成综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养平板。吸取上述热处理后的样本0.5 mL均匀涂布于综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养平板，每瓶样本取样10次并涂布于10个综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养平板，将涂布好的培养平板置于37 ℃培养48 h，培养平板上长出单菌落。无菌操作下，将每个单菌落分装于2个灭菌离心管中，其中1份用于菌种鉴定和DNA测序分析，另一份用于后续研究。无菌操作下用挑取少量菌体样本，涂抹于载玻片上，吹干。向载玻片滴加2滴质量分数5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，微火上加热染液，待出现蒸气时计时，并维持5 min。待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。用质量分数0.5%番红水溶液复染2 min后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。将载玻片晾干后用油镜观察，以菌体内部存在墨绿色囊状体作为判定芽孢菌的依据，确定分离获得的菌株为芽孢菌，保留孔雀绿染色结果为芽孢菌的样品，后续用16S rDNA序列分析法鉴定，确定其种属。

1.2 人参叶片中芽孢菌的鉴定

对分离的样品进行形态学鉴定，将纯化后的菌种，均接种于新的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上进行活化，相应菌种培养相应时间(天)，观察不同菌种的菌落形态、颜色、质地、纹饰、色素等生长情况进行鉴定；而后采用微量菌体制成水载玻片，观察菌种的孢子生长，依据芽孢菌科图解，对菌种进行归属类的鉴别，鉴别到属。然后用16S rDNA序列分析法鉴定，根据测序结果，提交到NCBI Blast项目上进行基因序列比对，从而确定该待测芽孢菌菌株的种属。

16S rDNA序列分析法鉴定步骤：①提取菌体基因组DNA；②聚合酶链式反应扩增16S rDNA特异引物；③纯化扩增产物；④DNA测序、序列比对。

1.3 拮抗菌的筛选与平板对峙法对拮抗效果的检测

分别纯化培养上述分离鉴定的芽孢菌，培养条件：用综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养平板置于恒温培养箱25 ℃培养2 d，形成肉眼可见的小菌落；再分别接种到装有液体综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基的锥形瓶振荡培养，25 ℃、120 r/min摇床上培养36 h左右；待培养液中活菌浓度为2×109个/mL时停止培养；取其中单一菌种或它们的组合物作为后续拮抗试验中的接种样本。

在每一个综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养平板上设置试验组和对照组2个区域；培养平板的左侧接种黑斑病病原菌(作为对照组)；在培养平板的右侧先接种黑斑病病原菌，再在病原菌接种点的上下左右4个方位间距1 cm接种芽孢菌或其组合物；然后置于25 ℃恒温培养72 h，培养至72 h时分别测定试验组和对照组黑斑病或灰霉病的病原菌的菌落直径大小；根据试验组和对照组2个区域病原菌菌落直径的差别，判定芽孢菌或其组合物对病原菌的拮抗能力，试验组病原菌菌落直径越小说明芽孢菌或其组合物对病原菌的拮抗能力越强。

拮抗效率=[(对照组病原菌菌落直径-试验组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径]×100%。

将筛选出的具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌用于生物防治菌。

1.4 田间试验

试验地点设在黑龙江中医药大学清河中药材种子种苗基地(黑龙江省清河林业局育林林场)。人参茎单生，直立，4 a以上的人参4～6枚大小形状相同的掌状复叶轮生茎顶。选择4枚叶及以上的人参20株，每株随机选择4片叶分别喷施代森锰锌、扑海因、复合芽孢杆菌剂和空白处理。每间隔10 d喷施1次上述药物，连续3次。在施药后第5天，将2片人参黑斑病和1片人参灰霉病叶片(病斑直径1 cm左右)放入500 mL矿泉水瓶中，震荡1 min，制成致病菌液，然后立即喷在施药的叶片上，每间隔10 d喷施1次致病菌液，连续3次。

质量分数70%代森锰锌(四川国光农化股份有限公司)：500倍药液喷施。

质量分数50%扑海因(拜耳作物科学(中国)有限公司)：200倍药液喷施。

复合芽孢杆菌(4个菌种的菌株比例n(枯草芽孢杆菌)∶n(特基拉芽孢杆菌)∶n(贝莱斯芽孢杆菌)∶n(地衣芽孢杆菌)约为100∶60∶70∶40)：菌液浓度为108个/mL，叶面喷施。

空白对照：不喷任何药物。

计数每植株发病叶数和病情指数，与对照比较计算防治效果。以病斑面积占整个叶片面积比例(R)确定病情分级：0级为无病斑、1级为R≤5%、3级为5%50%以上。

病情指数={∑[(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×9)]}×100。

防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%。

2 结果与分析

2.1 人参叶片中芽孢菌分离鉴定结果

从不同产地人参叶片中培养的芽孢菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)，沾河的样品经培养获得110个菌落，庆安的样品经培养获得176个菌落，共获得286株(见表1)，其中：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)4种菌为优势菌种，枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌株比例为100∶56∶74∶40。

表1 不同产地人参叶片芽孢杆菌菌株数量

2.2 拮抗菌筛选与平板对峙法试验结果

在人参黑斑病病原菌的菌落周围的上下左右4个方位间距1 cm接种枯草芽孢杆菌后培养形成的菌落，进行平板拮抗试验(见图1)。培养条件：25 ℃，用综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基平板恒温培养72 h。在人参黑斑病病原菌的菌落周围的上下左右4个方位间距1 cm接种复合芽孢杆菌后培养形成的菌落，进行平板拮抗试验(见图2)。培养条件：25 ℃，用综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基平板恒温培养72 h。

图1 枯草芽孢杆菌拮抗抑制黑斑病病原菌

图2 复合芽孢杆菌拮抗抑制黑斑病病原菌

枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和由4种芽孢杆菌组成的复合芽孢杆菌，分别对黑斑病病原菌、灰霉病病原菌做平板对峙试验，分析4种芽孢杆菌与复合芽孢杆菌对黑斑病病原菌、灰霉病病原菌的抑制作用(见表2)。

由表2可见：4种芽孢杆菌与复合芽孢杆菌对黑斑病病原菌均有不同程度的抑制作用，4种芽孢杆菌中，枯草芽孢杆菌的抑制作用最强(抑制率为78.69%)、贝莱斯芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌次之、地衣芽孢杆菌的抑制作用最弱。复合芽孢杆菌抑制效果优于单一使用的其中任何1种，其抑制率高达89.74%，抑制率比枯草芽孢杆菌相对高出14.04%、比地衣芽孢杆菌相对高出27.96%。

由表2可见：4种芽孢杆菌与复合芽孢杆菌对灰霉病病原菌的抑制作用与对黑斑病病原菌的抑制作用非常相似，但对灰霉病病原菌的抑制效果弱于对黑斑病病原菌的抑制效果；其抑制率由大到小依次为枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。复合芽孢杆菌抑制效果优于单一使用的其中任何一种，复合芽孢杆菌的抑制率比枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌分别相对高出6.33%、23.38%。说明4种优势拮抗菌联合使用(按比例制成芽孢菌的复合物)，能够显著提高对人参黑斑病和灰霉病病原菌的抑制作用。

表2 4种芽孢杆菌与复合芽孢杆菌对黑斑病、灰霉病病原菌的抑制效果

2.3 复合芽孢杆菌对人参黑斑病和灰霉病的防治结果

在黑龙江中医药大学清河中药材种子种苗基地(黑龙江省清河林业局育林林场)进行试验，每间隔10 d喷施1次上述药物，连续3次，统计复合芽孢杆菌田间防治效果(见表3)。由表3可见：复合芽孢杆菌对黑斑病的防治效果较好(达到85.9%)，高于扑海因，与代森锰锌接近无显著性差异；复合芽孢杆菌对灰霉病的防治效果达53.8%，低于扑海因，与代森锰锌无显著性差异。复合芽孢杆菌对黑斑病与灰霉病总体防治效果为65.1%，与代森锰锌总体效果无显著性差异；虽然低于扑海因的效果，但是复合芽孢杆菌没有农药残留，不会对环境造成影响，是一种环境友好型的生物菌剂。

表3 复合芽孢杆菌田间防治效果

3 结论与讨论

代森锰锌和扑海因是人参黑斑病和灰霉病的常用农药，两种农药均为保护性药剂，不具有内吸性。本研究采用复合菌剂防治人参2种常见病害，防治效果与代森锰锌接近，略弱于扑海因。人参是药食两用名贵药材，不仅在国内需要量较大，而且大量出口国外，人参农药残留问题一直是人参商品销售的关注热点。本复合菌剂的开发应用有利于促进绿色人参的生产发展。

生态位是指一个种群在生态系统中，在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的关系与作用，是一个物种的食物、习性、栖息地等生活要素的集合。不同菌种的生活要素有重合部分，所以虽然有很多物种能够在特定环境中生存，任一环境因素的改变都可能会有利于其中的某些生物物种生存，而对其他生物不利。本研究采用的生防菌与人参常见病害的黑斑病菌、灰霉病菌均生长在人参叶片上，生态位极为接近。根据达尔文生物竞争理论，群落中不同物种之间、种内和种间的个体之间，无时无刻不在进行着竞争，人为增加生防菌的数量，占据人参叶片一定空间，减少病原菌生存可用的叶面资源，从而减少病原菌的数量，使病害得到有效控制。埃尔顿(Charles Sutherland Elton)的经典观念认为，结构简单的群落种群越复杂，外来物种越不容易入侵[17]。事实上，外来物种容易入侵单一种群，如种植的农作物种群单一，病原菌容易侵入，病害严重，这是栽培人参容易发病的原因之一。从另一角度看，人参叶片微生物种群多样性丰富，病原菌也不易侵入。因此，本研究采用枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌4种菌为优势菌种进行生物防治。与化学防治相比，采用对病原菌的拮抗菌株可更加有效防止病原菌的侵入，同时还可以达到绿色环保的生态效果。