桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶功能性对比*

马艳蕊，王顺明，李学震，王 华，和法涛，刘光鹏**

（1.中华供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250200；2.安丘市农业农村局，山东 潍坊 262100；3.北京京东乾石科技有限公司，北京 102600）

桑黄（Phellinus igniarius）属担菌子门（Basidiomycota）伞菌纲 （Agaricomycetes）锈革孔菌目（Hymenochaetales）锈革孔菌科 （Hymenochaetaetaceae）桑黄属（Phellinus），是一种珍贵的药用真菌，子实体多呈黄褐色，是生长于多种树木上的硬质大型真菌。根据寄生树种的不同，桑黄的颜色、形状和成分也略有差异，目前世界上已知的桑黄菌种有15种，在中国境内有10种[1]，其中人们所熟知的主要有桑树桑黄（Inonotus hispidus）、东北桑黄（Sanghuangprous vaninii）等。桑黄始载于《药性论》，具有活血、止血、化饮、止泻等功效；随着现代医学的发展，桑黄更多的药理作用也逐渐被发掘。最新的研究表明，桑黄具有明显的抗癌、抗肿瘤作用，能够有效抑制肿瘤细胞的生长和转移，且不会对人体造成任何毒副作用[2-8]。目前，桑黄多以子实体形式被人们所食用，食用方式单一且口感不佳，因此亟需开发出一种桑黄精深加工产品使其为更多的消费人群所接受。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）属子囊菌门（Ascomycota）散囊菌纲 （Eurotiomycetes）散囊菌目（Eurotiales）发菌科 （Trichocomaceae）散囊菌属（Eurotium），是我国传统茯砖茶中的优势菌种，能赋予茯砖茶特殊的香气，且具有降脂降糖、改善人体消化道功能、抗菌和抗氧化等作用[9-10]。随着微生物学和发酵工程的发展，人们越来越清楚的认识到冠突散囊菌在改善发酵茶品质、提升食品生物技术应用水平，尤其在肠道微生态调节剂方面的应用价值具有广阔的前景[11]。

茶叶作为一种中国传统饮品，具有广泛的消费群体。当前国内以冠突散囊菌为优势菌种的茯砖茶加工工艺已经比较成熟，而有关桑黄茶的研究鲜有报道，因此本研究拟以桑叶红茶为培养基底，分别接种桑黄菌和冠突散囊菌，对比研究其中不同功能成分的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源

发酵菌株东北桑黄D（Phellinus igniarius）由山东省临清市哲硕农产品有限公司提供，冠突散囊菌（Aspergillus chevalier）i由市售安化黑茶中筛选纯化得到。

1.1.2 培养基及试剂

PDA培养基，购自青岛宾得生物技术有限公司；PDB培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），购自梯希爱化成工业发展有限公司；无水乙醇，购自天津富宇精细化工有限公司；碳酸钠，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；福林酚，购自上海麦克林生化科技有限公司；亚硝酸钠，购自天津市大茂化学试剂厂；硝酸铝，购自天津市大茂化学试剂厂；氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司。

桑叶红茶培养基：桑叶红茶由山东省临清市哲硕农产品有限公司提供，桑叶红茶复水后称取15 g置于培养皿中，经高压蒸汽灭菌制成桑叶红茶培养基。

1.2 仪器与设备

BSC-150恒温培养箱、YXQ-LX-100A高压蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；UV1000紫外分光光度计，上海天美仪器有限公司；HH-4恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化及种子液制备

取实验室保藏的桑黄斜面菌种，在超净工作台中用接种铲取约0.5 cm2接到PDA固体培养基上，置于28℃培养箱中恒温培养7 d～10 d，待菌种长满整个平板，保存在4℃冰箱备用。

取上述活化后的菌种平板，在超净工作台中用打孔器取相同大小的菌块接种于灭菌后的PDB培养基中，置于恒温摇床培养箱中28℃、180 r·min-1条件下摇培72 h。

冠突散囊菌菌种活化及种子液制备同桑黄菌种。

1.3.2 发酵桑叶红茶的制备

取上述活化后的桑黄和冠突散囊菌菌种平板，在超净工作台中用打孔器取相同大小的菌块接种于灭菌后的桑叶红茶培养基中，置于28℃培养箱中恒温培养7d～10 d，直至菌种长满茶叶表面。将发酵好的桑叶红茶置于45℃培养箱中过夜烘干。

1.3.3 羟自由基清除率测定

采用Xia等[12]的方法对羟自由基的清除率进行测定，略做改进。将烘干后的发酵红茶研磨成粉，用60%的乙醇按30∶1的比例加入到样品粉末中，30℃超声提取30 min后，再置于离心机中3 500 r·min-1离心10 min，将上清转移到50 mL离心管中，向沉淀中再次加入60%的乙醇，同样条件下再提取一次，合并2次的提取液，得到发酵桑叶红茶的醇提物。

取 8 mmol·L-1的FeSO4溶液和水杨酸溶液各1 mL混匀，取上步制得的醇提物0.1 mL，加入混合液中震荡摇匀，之后再加入3%的H2O2溶液1 mL，震荡摇匀使其充分反应。将混合液放置于水浴锅中，37℃条件下保温30 min，之后在510 nm处测定吸光度值。羟自由基清除率（P，%）的计算公式为：

式中：A1为样品反应体系的吸光度值；A2为去离子水代替H2O2反应体系的吸光度值；A0为去离子水代替醇提物反应体系的吸光度值。

1.3.4 DPPH自由基清除率测定

采用Jin等[13]的方法对DPPH自由基的清除率进行测定，略做改进。准确称取DPPH试剂5 mg，溶于250 mL无水乙醇中，配置成浓度为0.02 mg·mL-1的DPPH溶液；取上步中制备好的醇提物0.1 mL与DPPH溶液3.9 mL混合均匀，常温下避光20 min，之后于517nm处测吸光度。最终DPPH自由基清除率（Z，%）的计算公式为：

Z=[1-（A1-A2）/A0]× 100% （2）式中：A1为样品反应体系的吸光度值；A2为无水乙醇代替DPPH溶液反应的吸光度值；A0为无水乙醇代替醇提物反应体系的吸光度值。1.3.5 多酚含量的测定

取1 mL醇提物置于试管中，添加福林酚试剂1 mL，漩涡混匀，室温放置3 min；随后添加10%的Na2CO3溶液1 mL，漩涡混匀，置于恒温水浴锅中30℃条件下反应30 min，漩涡混匀；于760 nm处测定吸光度值。

1.3.6 黄酮含量的测定

取1 mL醇提物置于10 mL的刻度试管中，加入质量浓度为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，随后放置6 min；加入质量浓度为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min；加入浓度1 mol·L-1的氢氧化钠溶液4 mL，并用60%的乙醇稀释至刻度，在避光条件下放置15 min，随后于510 nm处测吸光度值。

1.3.7 多糖含量测定

取1 g发酵茶样品，置于50 mL离心管中，加入浓度为80%的乙醇25 mL，超声30 min后在4 000 r·min-1条件下离心10 min，弃上清。向沉淀中加入40 mL蒸馏水，在沸水浴中提取2 h，之后进行抽滤，残渣水洗2次～3次，将滤液定容到100 mL备用。

将样品稀释2倍后吸取1 mL加入试管中，加入浓度为5%的苯酚1 mL，快速加入5 mL浓硫酸，静置10 min后漩涡震荡，于30℃水浴中反应20 min，随后于490 nm处测吸光度值。

2 结果与分析

2.1 功能性成分及抗氧化活性分析

多糖是桑黄的主要生物活性物质，具有抗肿瘤、降血糖、护肝、免疫调节、抗氧化等生物活性[14]。而茶叶中含有丰富的多酚类物质，组成成分达30多种，主要包括黄酮类、苷类、黄烷醇类、黄酮醇类等，且绝大多数具有药理作用。此外，茶多酚具有极强的抗氧化活性，能与茶叶中的VE和VC等抗氧化剂产生明显的增效作用[15]。因此以多糖、多酚、黄酮含量、DPPH·清除率以及羟自由基清除率为指标，对比桑黄发酵桑叶红茶和冠突散囊菌发酵红茶的优劣，其统计结果见图1～图5。

图1 桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶中多糖含量对比Fig.1 Comparison of polysaccharide content in mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

图2 桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶中多酚含量对比Fig.2 Comparison of polyphenol content in mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

图3 桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶中黄酮含量对比Fig.3 Comparison of flavone content in mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

图4 桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶的DPPH·清除率对比Fig.4 Comparison of DPPH·scavenging rates of mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

图5 桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶的羟自由基清除率对比Fig.5 Comparison of hydroxyl radical scavenging rates of mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

由图1～图5数据发现，桑黄发酵桑叶红茶后产生了较多的多糖类物质，其多糖含量是对照桑叶红茶的2.69倍，达到0.410 mg·mL-1，且相应的具有较高的羟自由基清除率，羟自由基清除率为60.31%，这也与前人研究中多糖是桑黄的主要生物活性物质的结论相一致[16]。然而，桑黄发酵桑叶红茶中的多酚类物质与对照桑叶红茶和冠突散囊菌发酵桑叶红茶相比大幅下降，较对照桑叶红茶下降63.18%，只有30.55 μg·mL-1，黄酮含量较桑叶红茶下降24.55%，为27.38 μg·mL-1，可能是由于桑黄菌在生长过程中消耗了较多的木质素，同时DPPH·的清除率高低与茶中多酚含量具有相关性。冠突散囊菌发酵桑叶红茶后多糖类物质含量较对照桑叶红茶提升约83.17%，达到0.279 mg·mL-1，多酚类物质含量下降 14.75%，为 70.74 μg·mL-1，黄酮含量提升 67.13%，达到 60.65 μg·mL-1。

2.2 感官分析

接种不同菌种发酵对桑叶红茶的外观、香气会产生较大的影响。3种不同桑叶红茶的感官对比分析见表1。

表1 桑黄与冠突散囊菌发酵桑叶红茶的感官对比分析Tab.1 Sensory comparative analysis of mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

由表1所示，桑黄发酵后的桑叶红茶冲泡后颜色较浅，呈橙红色，且略浑浊，不透亮，香气相对较淡，但口感相对厚重；冠突散囊菌发酵后的桑叶红茶冲泡后色泽与未发酵桑叶红茶类似，呈棕红色，且茶汤清亮，香气比未发酵的桑叶红茶更加浓郁。

3 结论

分别用桑黄和冠突散囊菌发酵桑叶红茶，对比2种发酵茶和原茶的功能成分和抗氧化活性。结果表明与原茶相比，桑黄发酵桑叶红茶产生了更多的多糖类物质，且具有更高的羟自由基清除率；冠突散囊菌发酵桑叶红茶与原茶相比产生了更多的黄酮类物质，多糖类物质产量也有所提升。但2种发酵茶中的多酚类物质含量相比于原茶都有所降低，可能是菌种生长消耗了茶中的木质素所致。结合感官分析，冠突散囊菌发酵茶的茶香最为浓郁，颜色清亮，桑黄发酵茶的茶香较淡，口感比较醇厚，但颜色较浅略浑浊。综上所述，桑黄和冠突散囊菌发酵桑叶红茶在不同的功能性成分指标上都有所提升，香气和口感上也都各有优势，具有一定的研究价值和市场前景。