保湿时间对小麦赤霉病抗性鉴定结果的影响

张根源 胡润雨 陈向果 张漪 许豪 于士男 高艳 李巧云 唐建卫 殷贵鸿

摘要 为优化黄淮麦区小麦赤霉病抗性鉴定方法，于2020年在河南农业大学许昌校区试验田对4个小麦品种进行单花滴注赤霉病抗性鉴定，分析不同套袋保湿天数对病情严重度的影响，并利用与主效抗病基因Fhb1连锁的功能标记TaHRC-STS对其进行分子检测。结果显示：抗病品种‘苏麦3号‘宁麦9号携带该基因，而感病品种不携带;套袋1～7 d处理均引起赤霉病菌侵染，病情严重度随着套袋时间的延长而显著增加，在套袋4～7 d处理下，同一抗、感品种的严重度间无显著差异;且感病品种4～7 d的严重度显著高于1～3 d处理（P<0.05），抗性评价也与1～3 d不同，这表明Fhb1基因能增强小麦赤霉病抗性。进行赤霉病抗性鉴定时，黄淮麦区以套袋保湿4 d的处理效果较好。

关键词 小麦; 赤霉病; 保湿时间; 禾谷镰刀菌; 抗性鉴定

中图分类号： S435.121.45

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020704

Abstract In order to optimize the identification method of Fusarium head blight （FHB） resistance in Yellow and Huai River Valley wheat region of China， the FHB resistance of four wheat cultivars planted in experimental field of Xuchang campus of Henan Agricultural University were identified by single floret injection in 2020. The effects of different moisturizing days on the disease severity were analyzed， and then molecular analysis of the four wheat cultivars was performed using TaHRC-STS， a functional marker linked to Fhb1 gene of FHB resistance. The results indicated that resistant cultivars ‘Sumai 3 and ‘Ningmai 9 carried Fhb1 gene， while susceptible cultivars did not carry it， and the disease severity increased significantly with the extension of bagging time， and there was no significant difference between the same resistant and susceptible cultivars under bagging for four days to seven days. The severity of susceptible cultivars in 4-7 days was significantly higher than that in 1-3 days， and the evaluation of resistance was also different from that in 1-3 days， which indicated that Fhb1 gene could enhance the FHB resistance. In the identification of FHB resistance， bagging and moisturizing for four days was better in Yellow and Huai River Valley wheat region of China.

Key words wheat; Fusarium head blight; moisturizing time; Fusarium graminearum; resistance identification

小麥赤霉病主要是由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Schw.引起的小麦真菌病害。近年来，受全球气候变暖、轮作制度变化、秸秆还田措施等因素的影响，我国小麦赤霉病由长江中下游麦区开始向黄淮麦区迅速蔓延，发病面积日渐扩大[12]，已成为黄淮麦区小麦主要病害之一，严重威胁小麦生产。

培育和利用抗病品种是控制小麦赤霉病最简便、最有效、最环保的途径之一，而准确的抗性鉴定是选育抗病品种的基础[3]。小麦赤霉病抗性分为抗侵入（TypeⅠ）、抗扩展（TypeⅡ）、籽粒抗感染（TypeⅢ）、耐病性（TypeⅣ）和抗毒素积累（TypeⅤ）等5类[46]，最容易准确鉴定的是抗扩展能力，一般采用单花滴注的方法进行[78]。

小麦抽穗至扬花初期是最易被赤霉病菌侵染的时期，该时期空气湿度是影响小麦单花滴注后病菌侵染率的决定性因素[912]。通过对接种后的麦穗进行套袋保湿是保证空气湿度的有效措施，目前大多数单位通常采用套袋保湿3 d处理[13]。而我们在多年的赤霉病抗性鉴定实践中发现：黄淮麦区小麦抽穗至扬花期的天气条件不同于南方麦区，套袋3 d处理有时候不能保证充分的发病，尤其是在天气晴朗、多风、空气湿度低的年份更加明显，所以，套袋3 d不能完全适合黄淮麦区赤霉病抗性鉴定，但关于具体套袋天数的研究目前没有报道。基于分子标记的种质资源评价能够为新抗源的发现及利用提供一种有效途径[14]，Fhb1作为抗赤霉病主效基因被定位于小麦3B染色体短臂上，是目前抗性稳定且效应最大的位点，该基因已经被成功克隆[1517]。gzslib202204041404

本研究利用Fhb1基因最新开发的功能性标记TaHRC-STS对小麦供试品种进行分子检测，以明确是否含有Fhb1基因，以携带Fhb1的抗病品种与未携带该基因的感病品种为材料，分析不同套袋天数对小麦赤霉病抗性鉴定结果的影响，旨在明确黄淮麦区单花滴注最佳套袋时间，为赤霉病抗性的准确鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试小麦品种

供试小麦品种为‘苏麦3号‘宁麦9号‘扬麦158和‘周麦18，其中‘苏麦3号为高抗品种，‘宁麦9号为中抗品种，‘扬麦158为中感品种，‘周麦18为高感品种。4个品种均由河南农业大学小麦遗传育种实验室保存和提供。

1.2 田间试验设计

试验在黄淮麦区中部的河南农业大学许昌校区小麦试验田进行，该地区地势平整，排灌方便，土质为壤土，前茬为玉米，肥力水平较高，于2019年-2020年度将小麦供试品种进行秋播，采用人工开沟点播的方式，随机排列，3次重复，每品种2行，行长3 m，株距10 cm，宽窄行40 cm×20 cm种植。‘宁麦9号‘扬麦158与‘苏麦3号开花初期为4月9日-10日，‘周麦18开花初期为4月18日。

1.3 致病菌的培养、田间接种与抗性评价

致病菌为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Schw.菌株14YY1-3、14KF3-8、14ZK1-4的混合菌株，由河南省农业科学院植物保护研究所提供，致病菌培养及孢子悬浮液制作参考徐飞等[9]的方法，悬浮液于接种前3 d 制备，接种前将各菌株等孢子量混合，用灭菌蒸馏水调至分生孢子浓度为5×105个/mL。

在小麦开花初期（10%麦穗中部开花），将20 μL配制好的孢子悬浮液（加入2～3 μL 96%的Tween-20），使用微量移液器注入麦穗中上部（从穗顶端往下第5排小穗）的1个小花内，并套袋保湿，共设置1、2、3、4、5、6、7 d等7个套袋时间处理。对接种麦穗进行剪芒标记，每个品种每个处理接种20穗。接种后21 d，调查发病小穗数、总小穗数及穗轴侵染情况，计算病小穗率（percentage of diseased spikelet， PDS）。

参照国家农业行业标准（NY/T 1443.4-2007）《小麦抗病虫性评价技术规范》第四部分：“小麦抗赤霉病评价技术规范”进行抗性评价。首先依据病小穗率及穗轴侵染情况进行病情严重度等级划分，分为0～4共5个等级，其中0级为接种小穗无可见发病症状;1级为小穗发病或相邻个别小穗发病，病斑不扩展到穗轴;2级为穗轴发病，病小穗率<1/4;3级为穗轴发病，病小穗率1/4～1/2;4级为穗轴发病，病小穗率>1/2。计算供试小麦品种平均严重度并进行赤霉病抗性的5级抗性评价，分别为免疫（I，X=0）;抗（R，0

利用统计软件IBM SPSS Statistics 20.0对4个小麦品种不同套袋天数病小穗率与严重度进行差异显著性分析（Duncans multiple range test）。

1.4 田间温湿度测定

采用Cos-03温湿度记录仪（USB-TH）测定田间温湿度变化，将其固定于田间并与小麦穗部同高，每隔10 min记录一次温湿度值，并根据温湿度值对喷水时间进行相应调整，即每天10：00-14：00之间，当温度高于25℃时用喷水带进行喷水保湿，当湿度超过85%时停止喷水，当湿度低于70%时再次进行喷水，由于环境因素如天气、风力等对空气湿度的影响，每次喷水时间10～15 min不等，确保每天温度在25℃左右时相对湿度维持在80%左右。连续记录4个小麦品种从套袋第1 天到调查统计发病小穗数（21 d）。

1.5 抗病基因Fhb1的检测

1.5.1 小麦基因组DNA提取

采用CTAB法[18]提取小麦基因组DNA，干燥后溶于TE缓冲液，4℃保存备用。

1.5.2 分子标记检测

选用Su等[16]开发的功能性标记TaHRC-STS对Fhb1基因進行检测（引物序列：F： 5′-ATTCCTACTAGCCGCCTGGT-3′，R： 5′-ACTGGGGCA-AGCAAACATTG-3′），以‘苏麦3号为阳性对照，‘周麦18为阴性对照，所扩增出阳性片段和阴性片段大小分别为1 300 bp和2 000 bp。PCR体系和扩增程序：总反应体系为20 μL，其中2×Taq MasterMix（Dye）（北京康为世纪生物科技有限公司）10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA（50 ng/μL） 2 μL，超纯水6 μL;在Applied Biosystems PCR仪（赛默飞世尔科技公司Thermo Fisher Scientific）上进行PCR，扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环;最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。引物合成由生工生物（上海）股份有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 不同保湿时间（套袋天数）对赤霉病抗性评价结果的影响

从表1中可看出，当套袋天数≤4 d时，赤霉病平均严重度随着套袋天数的增加而增加;当套袋天数≥4 d时，平均严重度达到最大，套袋4～7 d处理的同一品种（包括抗病和感病）的严重度间无显著差异。两个抗病品种‘苏麦3号与‘宁麦9号在套袋天数为3 d和4 d时平均严重度无显著差异，而两个感病品种套袋天数≥4 d时的严重度显著高于套袋3 d处理，且抗性评价结果也不同，3 d套袋处理的‘扬麦158与‘周麦18的鉴定结果分别为中抗（MR）与中感（MS），而4～7 d处理的鉴定结果分别为中感（MS）与感（S）（图1）。gzslib202204041405

2.2 田间温湿度测定结果

从不同小麦品种接种赤霉菌（最早的4月9日、最晚的4月18日）到统计发病小穗数（最早的4月30日、最晚5月9日）共计30 d温湿度变化如图2所示。

田间湿度由于受到其他环境因素如气温、风力等影响较大而出现波动，相对湿度的变化范围为37.8%～99.9%，但30 d平均湿度达到83.8%;空气温度变化范围为1.8～36.6℃，30 d平均气温达到 17.4℃。通过喷水保湿并记录相关温、湿度，保证能够为小麦赤霉病抗性鉴定创造良好且湿度相对稳定的发病环境。

2.3 抗病基因Fhb1检测结果

用抗赤霉病基因Fhb1功能性标记TaHRC-STS检测4个小麦品种基因型，结果显示（图3），‘苏麦3号‘宁麦9号扩增出1 300 bp的目的片段，而‘扬麦158和‘周麦18扩增片段大小为2 000 bp，表明‘苏麦3号‘宁麦9号携带Fhb1抗赤霉病基因，而‘扬麦158和‘周麦18没有携带Fhb1抗赤霉病基因。套袋4 d处理田间抗赤霉病单花滴注鉴定结果表明，‘苏麦3号‘宁麦9号的抗性分别达到抗（R）、中抗（MR）水平，而‘扬麦158和‘周麦18的抗性水平分别为中感（MS）和感（S）。

3 讨论

小麦赤霉病抗性鉴定结果受环境的影响，同一小麦品种在不同年度与地点间的鉴定结果可能不一致[19]。如‘扬麦158在长江中下游麦区多年鉴定结果为中抗[1，20]，但同时也有报道指出‘扬麦158中感赤霉病[2122]。本研究团队在黄淮麦区经过多年抗性鉴定，其鉴定结果均为中感。因此，本研究中将‘扬麦158作为中感对照。

赤霉病抗扩展主要通过单花滴注的方法进行，通常采用套袋3 d处理[2326]。本研究结果表明，在黄淮麦区接种鉴定时不同套袋时间小麦赤霉病发病程度有较大的差异。不同抗性小麦品种在套袋1～7 d处理下均可以被赤霉病菌侵染，抗、感品种的平均严重度均随着套袋时间的延长而显著增加。当套袋天数≥4 d时小麦赤霉病均能够充分发病，各品种平均严重度间无显著差异;当套袋天数<4 d时，感病品种平均严重度与4～7 d相比差异显著（P<0.05），抗性评价结果也不同。套袋时间过短会影响赤霉病菌繁殖和侵染，小麦发病不充分，抗性评价不准确，时间过长则会使袋内温度过高影响赤霉病菌生长，且由于蒸腾作用导致袋内水分过多，小麦穗下节承重增加，遇到刮风天气容易折断[2728]。综上所述，在黄淮麦区通过单花滴注进行赤霉病抗性鉴定，套袋4 d处理比较合适，既能确保小麦赤霉病充分发病，又能减少套袋对小麦正常生长发育的影响。

利用抗赤霉病主效抗病基因Fhb1分子标记辅助选择技术已成为提高小麦品种赤霉病抗性的有效手段。张宏军等[29]以‘生选6号为供体构建的回交群体与轮回亲本‘周麦16号相比，平均病小穗数和平均病情指数均显著降低。Bemardo等[30]利用分子标记将‘宁7840所携带的Fhb1导入到美国硬粒冬性小麦中，赤霉病抗性得到显著提高。我国长江中下游麦区同样利用Fhb1基因育成了‘宁麦9号‘宁麦13等赤霉病抗性良好的小麦品种[31]，而黄淮麦区作为我国小麦主产区，目前还没有大面积推广中抗品种或高抗品种。因此，导入Fhb1基因是提高黄淮麦区小麦品种赤霉病抗性的首要目标。本研究中，小麦品种‘苏麦3号‘宁麦9号经分子标记检测均携带Fhb1，赤霉病抗性均达到中抗及以上水平且平均严重度受套袋天数影响相对较小，验证了Fhb1赋予小麦较强的抗扩展能力，它也被公认为是目前发现效应最大、抗性最稳定的抗赤霉病基因[3234]。

稳定且准确的田间赤霉病抗性鉴定是小麦抗赤霉病育种工作的保障，而能够对不同小麦品种作出准确抗性评价的前提则是确保接种的赤霉病菌充分侵染发病。本研究选择代表性的抗、感品种，并结合抗赤霉病主效基因Fhb1分子标记检测，通过设置不同套袋天数处理得出了黄淮麦区单花滴注最佳保湿时间（套袋4 d），有助于优化小麦赤霉病抗性鉴定方法，得到准确的赤霉病抗病性鉴定结果，为黄淮麦区小麦抗赤霉病遗传育种提供了技术参考。

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