一株较强致病性鸡大肠杆菌的分离与防控

乔欣君 厦门惠盈动物科技有限公司 福建厦门 361023

家禽养殖过程中，细菌性疾病尤为常见，且传染快、发病率与病死率较高[1]。 某养鸡场鸡群突发疾病，其症状为体温升高，精神不振，食欲降低或停食，排灰白色稀便，且传染快、发病急、病死率高。通过解剖分别从肺、肝、脾脏3 种器官分离纯化得到活菌数较高的一株病原菌， 最终确定为大肠杆菌（Escherichia coli）。

国内外关于鸡大肠杆菌病防治的报道较多[2-5]，其中多数以抗生素类药物作为治疗首选方案， 而抗生素的大量使用会引起多种负面影响， 例如提高细菌的耐药性、动物机体免疫下降、药物残留及其生态环境破坏等[6]。 当有药物残留的畜禽肉类产品进入人体并在人体富集，则会对人体健康产生危害[7-8]。农业农村部第194 号公告要求2020 年7 月起饲料端禁抗、养殖端限抗减抗，而益生菌作为有活性的微生物，具有抗菌活性却无抗生素所带来的种种弊端，它不仅能改善动物肠道健康， 还能促进食物在动物消化道内消化，提高饲料利用率，是抗生素的替代品之一[9]。

本研究从病死鸡的肺、肝、脾脏3 种器官分离出大肠杆菌，通过链霉素、新霉素、庆大霉素等9 种抗生素进行药敏试验，并利用枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、 植物乳杆菌等9 株益生菌进行大肠杆菌抑制试验。通过药敏试验及益生菌抑菌试验，从而确定最佳的治疗方案， 为鸡细菌性疾病的防治提供一条绿色环保的道路， 也为益生菌产品的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病样 由某鸡养殖场提供病死鸡若干羽，且死亡不超过12 h。

1.1.2 供试药物 链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、阿莫西林、氧氟沙星、利福平、氨苄西林9 种抗生素药敏纸片， 购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 供试益生菌 枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母，均为本单位实验室分离保存。

1.2 病原菌分离与鉴定 随机选取3 羽病死鸡，解剖后取出肺、肝、脾脏，用灼热的刀片烫死表面杂菌，再通过无菌操作分别将组织剪碎， 采用无菌生理盐水稀释100 倍混匀后，吸取0.1 mL 涂布营养琼脂培养基平板，肺、肝、脾脏各1 个平板，总共9 个平板，倒置于37 ℃培养箱培养24 h，长出单菌落后再划线纯化培养。

纯化后的菌株采用16S rRNA 细菌通用引物[10]进行扩增， 正向引物为27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 反向引物为 1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'， 由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。 所得序列经过NCBI（美国生物技术信息中心） 数据库的BLAST 进行在线同源性比对，再参考《伯杰氏细菌鉴定手册》[11]与《常见细菌系统鉴定手册》[12]方法进行菌株生理生化试验及鉴定，试验项目包括：革兰氏染色特性、芽孢有无、糖发酵试验、V-P 试验、吲哚反应、硝酸盐还原、淀粉水解、明胶液化等。

1.3 药物敏感性试验 采用药敏纸片琼脂扩散法[13]。吸取 1 mL 活菌数约为 108CFU/mL 的菌液，加入15 mL 营养琼脂培养基中（50 ℃），混合均匀后倾注倒入灭菌培养皿中，冷却凝固后贴上药敏纸片，静置20 min 后， 将平皿置于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.4 益生菌抑菌试验 采用管碟法[14-15]。取1 mL 菌悬液加入50 ℃ 100 mL 营养琼脂培养基中， 摇匀（含菌终浓度为105CFU/mL），倒入培养皿中（厚度约为3 mm），待冷却凝固后将牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入 0.25 mL 益生菌培养液 （浓度为108CFU/mL），置于37 ℃下培养24 h。观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.5 动物模拟试验 随机选取60 只健康小鼠，分成3 组、每组20 只，分别为对照组、大肠杆菌感染组、益生菌保护组。 3 组小鼠同等条件饲养3 d 后，感染组皮下注射分离菌1 mL（浓度为106CFU/mL）；益生菌保护组皮下注射分离菌1 mL （浓度为106CFU/mL），同时饮水中加入复合乳酸菌发酵培养物； 对照组注射1 mL 灭菌生理盐水。 各组隔离饲养，自由饮水，连续观察7 d。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离与鉴定 病死鸡肺、肝、脾脏经剪碎、稀释100 倍后涂布培养，分离得到圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起的菌落，且该菌株在3 个器官中均有分布，活菌数较高。 纯化后的菌株采用 16S rRNA 扩增测序， 获得的片段长度为1 417 bp，扩增测序结果见图1。 该菌株基因序列通过BLAST 软件进行同源性比对，结果与Escherichia coli SCU-308 的同源性为99.93%。

图1 菌株基因扩增测序结果

该菌株的生理生化试验结果为： 革兰氏染色阴性、无芽孢，MR 试验、吲哚反应、糖发酵试验等为阳性，V-P 试验、淀粉水解试验为阴性，结果见表1。 结合16S rRNA 扩增测序结果，通过查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》，可以确定该菌株为大肠杆菌。

表1 菌株生理生化特性

2.2 药物敏感性试验 从病死鸡中筛选获得的大肠杆菌，用链霉素、新霉素、庆大霉素等9 种抗生素进行药敏试验，以确定该菌株的耐药性。该大肠杆菌分离株对链霉素表现敏感， 对卡那霉素表现中度敏感，对新霉素、庆大霉素、四环素等其它7 种常见抗生素表现不敏感（见表2）。 该结果与于鹏杰[16]、程汉等[17]及郭延敏[18]的研究结果存在差异，说明不同来源分离的大肠杆菌，其耐药性差异较大，且表明抗生素的长期使用提高了大肠杆菌的耐药性[19-21]。

表2 大肠杆菌对9 种药敏纸片的敏感性

2.3 益生菌抑菌试验 用本单位实验室的9 株益生菌对大肠杆菌进行抑制试验。由表3 结果可知，大肠杆菌对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等乳酸菌表现极敏感，对凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌表现高敏感， 对枯草芽孢杆菌表现低敏感，对酵母菌不敏感。 有研究表明[22-24]乳酸菌通过产生抗菌物质，从而达到抑制有害细菌的生长，其中植物乳杆菌、 干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌是产生抗菌肽来达到抑制病原菌的作用[25-28]。

表3 9 种益生菌对大肠杆菌的抑制效果

2.4 动物模拟试验 将分离得到的大肠杆菌及植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌等乳酸菌复合发酵培养的发酵液进行动物（小鼠）试验。试验表明，未作任何处理的对照组7 d 内无小鼠死亡； 大肠杆菌感染组小鼠在3 d 内死亡率达90%； 益生菌保护组小鼠在注射分离菌后第1 d 死亡2 只， 死亡率为10%，与大肠杆菌组差异显著（P＜0.05），见表 4。剖检死亡小鼠， 可见肝脏水肿、 脾脏及肺点状出血等症状，取小鼠的肺、肝、脾脏划线接种营养琼脂平板，长出菌落；划线纯化，经过16S rRNA 扩增测序，表明该菌与试验注射的大肠杆菌为同种细菌， 说明该大肠杆菌对小鼠有较强的致病能力。 而解剖存活的益生菌保护组小鼠，未见剖检病变，说明复合乳酸菌发酵液能有效抑制大肠杆菌。

表4 动物模拟试验结果

3 结 论

从病死鸡的肺、肝、脾脏中分离出一株具有较强致病性的大肠杆菌，该菌对新霉素、庆大霉素、四环素等7 种常见抗生素具有耐受性，而对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等乳酸菌敏感。通过动物试验表明， 本次试验所用的复合乳酸菌发酵液能有效抑制大肠杆菌， 从而降低或预防由大肠杆菌引起的细菌性疾病的发生。 建议在实际养殖过程中，若发生细菌性疾病，应先做药敏试验，对症用药，避免抗生素的滥用。 或在日常养殖过程中使用益生菌产品，以减少或预防细菌性疾病的发生，从而减少或替代抗生素的使用。 根据本次试验所用复合乳酸菌抑制大肠杆菌的研究结果， 后续将进一步检测乳酸菌对其它种类致病菌的抑制效果，同时优化菌株复配、发酵培养基及发酵培养条件等相关技术问题， 为益生菌产品开发奠定良好的基础。