石菖蒲-茯苓合用治疗阿尔茨海默症作用机制探讨

吴 婷，李万敏，李勋章，邸 学，王海波

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性神经系统退行性疾病，易发于老年人群。该病临床主要表现为记忆力衰退、认知功能障碍、行为障碍、判断能力及性格行为异常等。目前认为其发病机制包括β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白过度磷酸化、炎症反应、胆碱能缺失、氧化应激、金属离子紊乱、胰岛素抵抗、粒体功能障碍及菌群-肠-脑轴失调等[1-2]。

在中医学中，AD归属于“痴呆”“呆病”等范畴，常以“益气健脾、化痰开窍”“活血化瘀、豁痰开窍”等治法进行治疗，常用方剂包括地黄饮子、开心散及当归芍药散等[3]。经典方剂开心散、地黄饮子等古方中以茯苓、石菖蒲配伍使用，而现代脑肠轴理论为其应用机制提供了新阐述。脑肠轴是脑-肠相互作用双向调节轴，其上行调节的途径包括神经途径、体液途径和免疫途径[4]，是中枢神经系统在很多方面与胃肠道神经系统互相链接的表现[5]。肠道可以参与中枢神经系统的调控机制，如益生元、益生菌等可引起tau蛋白过度磷酸化、β-淀粉样蛋白沉积等与神经系统病变相关反应[6]。因此，分析常配伍使用的调理胃肠药物茯苓与醒神开窍药物石菖蒲的联合作用机制，有助于AD治疗创新药物的研发。

石菖蒲属开窍药，为天南星科植物石菖蒲(AcortwtatarinowiiSchott)的干燥根茎，其味苦，微辛，入心、胃经，具有化湿开胃、开窍豁痰、醒神益智之功效，对心肾失养所致的耳鸣、失眠、健忘有疗效，常作为治疗脑病的必备药物[7]。茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核，其性平，味甘、淡，入心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效，还具有利尿、抗肿瘤、抗菌、改善记忆及抗氧化的药理作用[8]。

网络药理学融合多学科技术及内容，构建、整合“疾病-表型-基因-药物”多层次网络[9]，与中药多组分、多途径、多靶点协同调节的作用模式极为相关[10]。因此，基于脑肠轴理论，以石菖蒲醒神开窍作用于“脑”及茯苓利水渗湿健脾功效为探讨对象，开展网络药理学研究，分析石菖蒲-茯苓合用治疗AD疾病的中枢神经系统与胃肠道作用的综合机制，为今后治疗AD疾病提供新参考。

1 材料

数据库：中药系统药理数据库(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/443027)，SwissTargetPrediction数据库(http：//swisstargetprediction.ch/)，STRING数据库(http：//string-db.org)，DisGeNET数据库(http：//www.disgenet.org/search)，DrawVen nDiagram数据库(bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)，KEGG数据库(http：//www.kegg，jp)，DAVID数据库(http：//david.ncifcrf.gov)，Omicshare在线平台(https：//www.omicshare.com/)。

2 方法与结果

2.1 石菖蒲-茯苓活性成分筛选

通过TCMSP数据库检索“石菖蒲”和“茯苓”化学成分，得到石菖蒲的化合物105个，茯苓的化合物34个。以口服生物利用度(OB)值≥30%，类药性(DL)值≥0.1为条件进行筛选，得到31个候选化合物，见表1。

表1 石菖蒲(A)-茯苓(P)的活性化合物

2.2 候选化学成分靶点预测

经SwissTargetPrediction数据库及TCMSP数据库检索分析得到化合物的基因靶点，对比、去重，得到486个基因靶点。

2.3 获取AD相关靶点

通过DisGeNET数据库，以“Alzheimer’s disease”为关键词，检索到AD相关靶点3 397个。

2.4 中药药对-疾病靶点构建

将“2.2”项中所得化合物预测基因靶点与“2.3”项中的疾病基因靶点导入DrawVennDiagram数据库，绘制韦恩图，获得石菖蒲-茯苓药对作用于AD疾病的潜在基因靶点，确定石菖蒲-茯苓药对作用于AD疾病的潜在作用基因靶点为286个，见图1。

图1 中药药对-疾病靶点

2.5 靶点KEGG通路分析

将“2.4”项中交集靶点分别输入KEGG数据库、DAVID数据库和STRING数据库，进行KEGG通路富集及靶点基因的相互作用分析。

富集到通路为130条，以基因数为筛选条件，选择癌症通路(Pathways in cancer)、刺激神经组织的配体受体交互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)通路及PI3K-Akt信息通路(PI3K-Akt signaling pathway)等10条通路，见表2。利用Omicshare在线平台绘制前10条KEGG网络图，见图2。Degree>4的主要通路为PI3K-Akt signaling pathway和Calcium signaling pathway。而4条以上通路出现基因互扰作用有32个，其中有MAPK3、CHRM1、MAPK8及ADORA2A等7个基因是石菖蒲与茯苓化合物共同通过不同通路作用于AD疾病的主要基因靶点，见表3。

图2 KEGG网络分析

表2 石菖蒲-茯苓治疗AD潜在基因靶点的主要通路

表3 石菖蒲-茯苓作用通路共同基因

靶点基因相互作用分析，选择Homo sapiens，设置参数值high confidence(0.70)，见图3。其中Degree>5有10个，分别为HSP90AA1、EGFR、HSP90AB1、JAK2、EP300、ESR1、ESR2、FKBP4、ITGB3、LYN，见图4。

图3 潜在靶点基因的相互作用

图4 核心靶点相互作用

2.6 成分-核心靶点-通路网状模型构建

利用Cytoscape 3.6.0软件构建“成分-潜在靶点-通路”之间的网络模型图，进一步观察候选成分、潜在作用靶点及所涉及通路的关系，见图5。

图5 成分-核心靶点-通路网络

石菖蒲-茯苓活性成分的核心作用靶点分布于不同代谢通路，相互协调作用，涉及多种机制，这体现了药对抗AD的作用。通过度的均值，选择大于均值的药对化合物有19个，见图6。其中Degree>35有Cerevisterol(啤酒甾醇)和kaempferol(山柰酚)，预测两化合物为石菖蒲-茯苓治疗AD主要化合物，其次为2′-O-Methylisoliquiritigenin(2′-O-甲基异甘草素)、8-Isopentenyl-kaempferol(8-异戊烯基-山柰酚)及trametenolic acid(栓菌酸)等17个。

图6 核心化合物-度值

3 讨论

通过网络药理学分析方法，探索石菖蒲-茯苓的药效作用，分析潜在的有效成分作用于生物网络中多条通路、多个靶点的情况，解析其干预疾病发生发展的作用过程。本研究筛选出石菖蒲与茯苓主要作用于AD的化合物为异菖蒲烯二醇(Isocalamendiol)、土青木香酮(Aristolone)、菖蒲烯二醇(Calamendiol)、山柰酚(Kaempferol)、2′-O-甲基异甘草素(2′-O-Methylisoliquiritigenin)、呋喃香豆素(Marmesin)、8-异戊烯基-山柰酚(8-Isopentenyl-kaempferol)、常春藤皂苷元(hederagenin)、栓菌酸(trametenolic acid)、啤酒甾醇(Cerevisterol)及齿孔菌酸(3beta-Hydroxy-24-methylene-8-lanostene-21-oicacid)11种。石菖蒲活性成分主要是挥发油、萜类及黄酮类化合物。石菖蒲挥发油可以改善学习记忆能力，对神经细胞有保护作用[11-12]。异菖蒲烯二醇、土青木香酮及菖蒲烯二醇是石菖蒲挥发油的活性成分，菖蒲烯二醇是进入脑组织中的脂溶性去痴灵成分[13]。黄酮类化合物山柰酚具有抗氧化，抗炎及预防脑I/R诱导的脑损伤的作用[14]。茯苓的主要化学成分是三萜类和多糖类，萜类成分具有抗炎、降血糖、抗氧化及免疫调节等药理作用[15]，常春藤皂苷元、栓菌酸及齿孔菌酸即为三萜类化合物，可能是其活性成分。

石菖蒲与茯苓的有效活性成分通过多条通路作用的相同基因靶点有MAPK3、MET、ADORA2A、CHRM1、CHRM2、KDR、MAPK8等。文献资料表明，MAKP3、CHRM1、ADORA2A及MAPK8靶点与神经功能作用有关，MAKP3(丝裂原激活的蛋白激酶3)是一种抗凋亡基因，参与神经元的可塑性，对于用外皮素治疗后大鼠海马中的Mapk3表现出明显的下调作用[16]。而CHRM1(胆碱能受体M1)是中枢神经系统中最重要的毒蕈碱受体，在神经元中高度表达，对CHRM1基因的敲除可减少NREM睡眠[17]，其减少也可影响手术绝经期恶化的记忆功能[18]及CHRM1基因表达被抑制后会削弱表达突变亨廷顿舞蹈病(HD)蛋白的稳定细胞系中Ca2+依赖的神经元信号转导[19]。ADORA2A(腺苷受体亚型A2a)是一种G蛋白偶联的腺苷受体，与海马体积变化具有显著关系[20]。因此，可推测这些基因可以作为今后治疗神经退行性疾病和认知能力下降的潜在靶标。

经通路富集分析可知，石菖蒲-茯苓药物作用以PI3K-Akt 信息通路和Ca2+信息通路2条通路为主，这2条通路与神经保护相关[21-23]。如山柰酚，可通过降低PI3K/Akt信号通路磷酸化水平进而促进细胞凋亡[24]，同时其对3T3-L1脂肪细胞的PI3K-Akt信号通路具有剂量相关的双向调节作用[25]。

综上，分析石菖蒲-茯苓不同成分、基因靶点和通路的不同作用方式，可为石菖蒲-茯苓合用干预AD疾病的研究与治疗提供参考。