玄参配方颗粒含量测定和特征图谱测定方法研究

杨晓彬，黄 勇，陈丹纯，江泽鸿

(康美药业股份有限公司，广东 普宁 515300)

中药材玄参(ScrophularianingpoensisHemsl.)为玄参科草本植物的干燥根，有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功效。主要用于热入营血、温毒发斑、热病伤阴、舌绛烦渴、津伤便秘、骨蒸劳嗽等[1]。

玄参多糖含量较高，容易发生吸潮、霉变和生虫现象，不易储存[2]。玄参配方颗粒是以符合炮制规范的玄参饮片为原料，经过现代工艺加工制成的一种统一规格、统一质量标准的新型配方用药，该药既可保证原中药饮片的特征，能满足医师进行辨证论治，随症加减，同时又具有不需要煎煮、直接冲服、服用量少、安全卫生、携带保存方便、易于调制和适合工业化生产等许多优点[3]。玄参已经分离出的化学成分有50多种，主要是环烯醚萜、苯丙素苷、有机酸及挥发油等，环烯醚萜苷中哈巴俄苷和哈巴苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿甲单孢菌均具有抗菌活性[4]。

本研究采用超高效液相色谱法对玄参配方颗粒的哈巴俄苷和哈巴苷的含量测定方法和特征图谱测定方法进行检验，为玄参配方颗粒替代传统药材的可行性研究和临床研究提供可行性依据。

1 仪器与试药

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色谱仪(二元泵、自动进样器、二极管阵列检测器，美国安捷伦公司)；OpenLAB CDS工作站(美国安捷伦公司)；ACQUITY UPLC© BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters)；ACQUITY UPLC© HSS T3色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters)；梅特勒-托利多XS205DU电子天平(十万分之一，瑞士梅特勒-托利多)；超声机(KQ-700VDB，昆山市超声仪器有限公司)。

甲醇(KRUDE，880502)、乙腈(KRUDE，880601)、磷酸(CNW，8620060)均为色谱纯，水为超纯水。

哈巴苷对照品(批号111729-201707，96.8%，中国食品药品检定研究院)；哈巴俄苷(批号111730-201709，95.9%，中国食品药品检定研究院)；桃叶珊瑚苷(批号111761-201707，100%，中国食品药品检定研究院)；毛蕊花糖苷(批号111530-201713，92.5%，中国食品药品检定研究院)；玄参对照药材(批号121008-201609，中国食品药品检定研究院)。

玄参配方颗粒(6批配方颗粒成品批号：1708014、1708015、1708016、2004016、2004017、2004018，康美药业股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 哈巴苷与哈巴俄苷含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品适量，加70%甲醇制成每 1 mL 含哈巴苷60 μg、哈巴俄苷20 μg 的混合溶液，即得玄参配方颗粒对照品混合溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取玄参配方颗粒，研细，约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇 50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率 350 W，频率 45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得玄参配方颗粒供试品溶液。

2.1.3 色谱分析条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACQUITY UPLC© BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；以乙腈为流动相 A，以0.03%磷酸溶液为流动相 B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.425 mL；测波长为210 nm(前7.5 min)，后变换为280 nm。理论板数按哈巴俄苷和哈巴苷计算均应不低于5 000。

表1 梯度洗脱

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性考察 分别取对照品溶液、配方颗粒供试品溶液和阴性样品溶液进行检测，结果表明，样品中各个峰分离较好，峰型对称，且阴性无干扰，表明该法专属性良好。见图1、图2。

图1 阴性样品溶液色谱

2.2.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2 μL，连续进样6次，测得哈巴苷和哈巴俄苷的峰面积RSD均为0.2%，保留时间RSD为0.6%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 线性关系考察 精密称取取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成哈巴苷系列对照品溶液(15 μg/mL，30 μg/mL，60 μg/mL，90 μg/mL，120 μg/mL)、哈巴俄苷系列对照品溶液(5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL)，分别吸取2μL进样，测定其峰面积，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，计算回归方程，结果显示哈巴苷回归方程：y=1.698x+0.625 34(r=0.999 937)，表明哈巴苷在15～120 μg/mL范围内具有良好的线性；哈巴俄苷回归方程：y=11.39701x+0.99622(r=0.999 949)，表明哈巴俄苷在5～40 μg/mL范围内具有良好的线性。

2.2.4 重复性试验 取同一批玄参配方颗粒，按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，精密吸取2 μL进样，测得哈巴苷和哈巴俄苷的含量平均值分别为2.325 mg/g和0.703 mg/g，RSD分别为0.8%和0.6%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收试验 取已知含量的同一批样品各0.5 g，精密称量6份，分别添加一定量的哈巴苷、哈巴俄苷对照品，按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，精密吸取2 μL进样，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD，结果见表2。哈巴苷、哈巴俄苷的平均回收率在95%～102%之间，且RSD均小于2%，表明该方法准确度良好。

表2 哈巴苷、哈巴俄苷回收率

2.2.6 稳定性考察 取同一批玄参配方颗粒，按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、16、18、24、36、48 h精密吸取2 μL进样，以哈巴苷、哈巴俄苷峰面积为参照，计算其余各峰的相对保留时间和哈巴苷、哈巴俄苷。结果各峰的相对保留时间和哈巴苷、哈巴俄苷含量无明显变化，RSD<2%，表明在48 h内供试品供试液稳定。

2.3 含量测定结果

按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，测定哈巴苷、哈巴俄苷的总量，结果如表3。结果表明，6批玄参配方颗粒哈巴苷、哈巴俄苷的总量均大于3 mg/g。

表3 玄参配方颗粒含量测定结果 (mg/g)

3 玄参配方颗粒特征图谱分析

3.1 参照物溶液的制备

取玄参对照药材 0.3 g，置具塞锥形瓶中，加入 30%甲醇25 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取桃叶珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含桃叶珊瑚苷20 μg、哈巴苷50 μg、毛蕊花糖苷20 μg、哈巴俄苷20 μg 的溶液，作为对照品参照物溶液。

3.2 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取0.2 g至具塞锥形瓶中，加入 30%甲醇25 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACQUITY UPLC© HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters)；以乙腈为流动相 A，以0.1%磷酸溶液为流动相 B，按表4中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3 mL、柱温为30 ℃、检测波长为210 nm，理论塔板数按哈巴俄苷峰计算应不低于5 000。

表4 梯度洗脱

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度试验 精密吸取对照品参照物溶液1 μL，连续进样6次，计算各个峰的相对保留时间和峰面积，测得峰面积RSD均小于1%，保留时间RSD<0.6%，表明仪器精密度良好。

3.4.2 重复性试验 取同一批玄参配方颗粒，按照“3.2”项下方法制备6份供试品溶液，精密吸取1 μL进样，以哈巴俄苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.4%和1.1%，表明该方法重复性良好。

3.4.3 稳定性考察 取同一批玄参配方颗粒，按照“3.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、16、18、24、36、48 h精密吸取1μL进样，以哈巴俄苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果相对保留时间和相对峰面积无明显变化，RSD<2%，证明供试品供试液在48 h内稳定。

3.5 特征图谱研究

玄参配方颗粒UPLC特征图谱的建立与相对保留时间研究：按“3.1”项下方法制备对照品参照物溶液和对照茵陈参照物溶液，按“3.2”项下方法制备6批样品供试品溶液，按“3.3”项下色谱分析条件记录0～20 min色谱图，通过匹配，生成对照图谱，建立玄参配方颗粒UPLC特征图谱，见图3、图4。6批玄参配方颗粒UPLC特征图谱中，均有6个特征峰，其中，1、2、3、5号峰分别为桃叶珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷，哈巴俄苷峰面积大，重现性好，可作为参照峰，计算4、6号峰与5号峰的相对保留时间，在规定值的5%范围之内。2个特征峰的相对保留时间分别为0.82(峰4)、1.05(峰6)，见表5。

图3 玄参配方颗粒UPLC特征图谱

图4 6批玄参配方颗粒UPLC特征图谱

表5 玄参配方颗粒6个峰的保留时间 (min)

4 讨论

有研究表明玄参经炮制后可使哈巴俄苷含量下降，而使哈巴苷含量升高[5]，因此本研究将测定玄参配方颗粒中哈巴俄苷和哈巴苷的总量作为控制玄参配方颗粒质量的方法之一。由于中药材的复杂性，建立准确有效的鉴别方法——特征图谱，可以从客观整体上评价中药材的质量，超高效液相色谱法与普通液相色谱法相比，灵敏度更高、速度更快，因此本实验将UPLC定量测定和特征图谱相结合，在测定哈巴俄苷和哈巴苷总量的基础上对玄参配方颗粒特征图谱进行研究，为玄参配方颗粒的质量控制和评价提供了参考依据。