武夷山不同海拔梯度黄山松土壤有机氮解聚酶活性及其影响因素

元晓春,林惠瑛,曾泉鑫,陈文伟,陈俊明,许敬华,陈岳民,林开淼,2,*

1 福建师范大学地理科学学院, 福州 350007

2 武夷学院旅游学院, 武夷山 354300

3 福建戴云山国家级自然保护区管理局, 德化 362500

氮是森林生态系统生产力和生态系统功能维持的最重要限制因子之一[1],其主要来源于土壤有机氮(SON,占土壤总氮的90%以上)[2]。最早的土壤氮有效性矿化-固持作用理论(Mineralization-immobilization theory,MIT)认为:“SON矿化决定生态系统氮循环”[3]。但后期的研究发现,SON由于分子量太大不能被植物和微生物有效吸收,必须在酶的作用下将含氮聚合物水解为小分子单体,才可以被植物和微生物同化和利用,这一过程被称为“解聚作用”,并据此提出“解聚作用是控制生态系统氮循环的关键过程”[4]。目前,全球范围内有关氮循环的研究更多关注土壤无机氮的转化(硝化作用、反硝化作用等)、含氮气体(N2O、NO等)排放、不同气候带矿质氮保持机制以及养分供应等内容[5—6]。然而,作为直接控制无机氮来源的“瓶颈”[7],SON解聚作用的研究却长期严重滞后。

受限于SON的解聚作用目前无法直接观测,研究人员只能尝试寻找代用指标来间接表征。SON的解聚作用本质上是在解聚酶的作用下将SON大分子聚合物进行水解,生成氨基酸、氨基糖、核酸等可以被微生物和植物直接或间接利用的小分子单体的过程[4,7]。因此,SON解聚酶是解聚作用强度和方向的关键控制因子,其活性的变化是目前用来表征解聚作用的有效指标[8—9]。SON解聚酶并不是某一种酶,而是能够将土壤含氮大分子聚合物逐步水解的一系列酶[7]。参与SON解聚作用的酶主要是蛋白酶,其次是几丁质酶、木质素酶和肽聚糖酶[7, 9]。因为植物和微生物残体是SON的主要组分,其化学组成包括蛋白质、几丁质、木质素和肽聚糖,而蛋白质占植物和微生物细胞氮的60%[10]。即使有研究表明,微生物可以直接吸收、矿化部分小分子蛋白质[11],但大多数蛋白质在跨膜运输之前必须经过蛋白酶参与的解聚作用[9]。温带或北方森林的已有研究表明中、低海拔土壤总碳[12],微生物[13],土壤质地和土壤pH[14]是影响SON解聚酶活性的主要因素。然而,目前对亚热带森林中、高海拔SON解聚酶活性的分布规律及其影响因素尚不明确。

海拔梯度变化对地球化学和生物的元素循环起着重要的作用[15],其调节温度和降水梯度,同时导致土壤养分以及土壤微生物群落等土壤特性发生自然变化[16]。武夷山国家自然保护区拥有全球同纬度现存面积最广、保存最完整的亚热带森林生态系统[17],是亚热带东南大陆海拔梯度最大的区域。与温带相比,虽然亚热带森林土壤相对氮饱和,但是该区域高温多雨,植被生产力旺盛,对氮养分的需求更高[18],SON解聚作用的变化对亚热带森林生态系统生产力的影响可能比温带地区更大。研究区海拔高350—2161 m,该区海拔变化提供了一系列土壤特性以检验SON解聚酶活性是如何受海拔影响。为排除不同植被类型的影响,我们选取海拔1200—2000 m的黄山松林作为研究对象,探究武夷山不同海拔梯度下黄山松SON解聚酶活性变化,并阐明不同海拔梯度下调节SON解聚酶活性的关键因素,以期预测环境变化对亚热带中、高海拔区SON解聚作用的影响。该研究有助于提高我们对土壤氮循环机理的认识,同时对预测环境变化对SON解聚的影响,认知亚热带黄山松林土壤有效氮保持和生产力的维持机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验区位于江西省武夷山国家自然保护区(27°48′11″—28°00′35″ N,117°39′30″—117°55′47″ E),海拔高350—2161 m,属于亚热带季风气候。年平均气温约14.2 ℃,年平均降水量约2583 mm,年平均湿度约84%,年平均蒸发量约778 mm,年平均无霜期为231 d[19]。

1.2 试验设计

采用典型样地调查法,于2014年10月,根据保护区内黄山松的实际生长及分布情况,选取海拔1200—2000 m之间的黄山松林作为研究对象。每200 m设置1个间隔,共设置了5个海拔梯度(包括2000、1800、1600、1400、1200 m)。每个海拔梯度设置3个样方,共设置15个20 m×20 m的样方,样方之间设有10 m以上的隔离带,用于防止样地之间相互干扰[19]。

采用“S”型5点取样法采样,于2019年7月,在每个样方内的表层土壤(0—10 cm)随机选取5个土芯。相同海拔梯度的土壤样品在去除石砾、碎屑以及植物根系后混合成一个均匀样,将土壤样品装入塑料自封袋用冰袋保鲜带回实验室处理。将每个样品分成2组,一组为鲜土,过2 mm筛后测定土壤酶活性、微生物生物量和土壤可溶性有机质；另一组为风干土用于测定其他土壤理化性质。

1.3 测定项目与方法

土壤酶活性的测定:采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定,按照试剂盒说明书进行操作。在最佳反应条件下,采用比色法对SON解聚酶活性进行测定。其中,碱性蛋白酶(ALPT)、酸性蛋白酶(ACPT)和中性蛋白酶(NPT)分别取0.02 g风干土,用0.2 M Tris(pH=8.0)提取,磁力搅拌器搅拌均质化后,混匀后在40 ℃下水浴30 min,采用福林酚比色法测定[22]；几丁质酶(Chi)通过取0.10 g风干土,用0.05 M醋酸钠(pH=5.0)提取,混匀后在37 ℃下培养24 h,采用二甲氨基苯甲醛比色法测定[23]；漆酶(Lac)通过取0.02 g风干土,用0.1 M酒石酸钠(pH=5)提取,在37 ℃下震荡反应10 min,冰浴5 min,采用ABTS氧化法测定[24]；锰过氧化物酶(MnP)通过取0.20 g风干土,用0.1 M酒石酸钠(pH=5)提取,混匀后在25 ℃下培养3 h,采用愈创木酚比色法测定[25]；谷氨酰胺酶(GLS)通过取0.10 g风干土,用0.05 M Tris(pH=8.6)提取,混匀后在37 ℃下培养2 h,采用奈氏比色法测定[26]；亮氨酸氨基肽酶(LAP)通过取0.05 g风干土,用0.2 M Tris(pH=8.0)提取,搅拌均匀后在37 ℃下培养1 h,采用对硝基苯胺比色法测定[27]。所测定酶的底物及特征吸收峰如表1所示。

表1 SON解聚酶的种类、缩写、相应底物和特征吸收峰

1.4 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析(Tukey)检验不同海拔梯度间土壤环境因子和土壤特性以及SON解聚酶活性的差异显著性(α=0.05)。采用R软件4.0.2将SON解聚酶活性与土壤环境因子、理化性质进行Pearson相关系数计算并绘图。利用Canaco 5.0软件进行冗余分析,探究海拔梯度下环境因子和土壤特性对SON解聚酶活性的影响。其他绘图由Origin 2018软件完成,图表中数据为平均值(标准差),n=3。

2 结果

2.1 不同海拔梯度下的土壤环境因子和理化性质

除土壤DON含量外,其他的土壤环境因子和理化性质在不同海拔梯度下均存在显著的差异(P<0.05)。从海拔1200—2000 m,ST随海拔升高显著降低,而SM显著增加(P<0.05)。SOC,TN、DOC和MBC随海拔升高呈波浪式起伏,均在海拔1600 m显著增加(P<0.05),在海拔1800 m降低,到海拔2000 m再次增加(表2)。此外,土壤pH在海拔1800 m显著升高,而MBN在海拔2000 m显著增加(P<0.05)。

表2 不同海拔梯度下土壤环境因子和理化性质

2.2 不同海拔梯度下的SON解聚酶活性

SON解聚酶活性在不同海拔梯度下均存在显著差异(P<0.05),并存在3种不同的变化趋势。从海拔1200—2000 m,ALPT、NPT、Lac和LAP活性随海拔升高显著增加(P<0.05)；ACPT和Chi活性随海拔升高先增后降,在海拔1800 m处达到最高值,到海拔2000 m显著降低(P<0.05)。相比于其他海拔,Mnp和GLS在海拔1800 m显著降低(P<0.05)(图1)。

图1 不同海拔梯度对黄山松SON解聚酶活性的影响

2.3 不同海拔梯度下的土壤矿质氮含量

图2 不同海拔梯度对黄山松土壤矿质氮的影响

2.4 不同海拔梯度下SON解聚酶活性的影响因素

图3 不同海拔梯度黄山松SON解聚酶活性与土壤环境因子、理化性质的相关分析

图4 不同海拔梯度黄山松SON解聚酶活性的冗余分析

3 讨论

3.1 不同海拔梯度下温度、水分和微生物等因素对黄山松SON解聚酶活性的影响

本研究中土壤温度和含水率是不同海拔梯度下SON解聚酶活性最大的两个影响因素(表3)。已有不少试验性增温实验发现,增温会抑制土壤酶活性[28—29]。一般来说,温暖环境下的土壤微生物会分泌较少的酶[28],由于酶的催化效率将随着温度的升高而增加[30]。因此,在解聚等量SON的前提下,低温度的高海拔区可能需要分泌更多的SON解聚酶。同样,土壤蛋白酶活性对土壤水分具有强烈生物依赖性[31]。近期一项meta分析也表明含水率增加可刺激氮循环酶活性[32],原因在于含水率增加会降低酶的固定化并增加其扩散速率[33]。反过来,干旱则抑制土壤酶活性[33],同时降低土壤酶催化效率[34]。相反,Chi与ST、SM的夹角接近90°,说明几丁质酶几乎不受温度和含水率的调节(图4)。据研究报道,几丁质酶具有很强的热稳定性,温度通常在小于60 ℃时均能保持很好的稳定性[35]。此外,我们还发现Chi与所测的土壤环境因子和理化性质均无显著的相关性(图3)。而本研究中几丁质酶随海拔升高而增加,但在海拔2000 m显著降低(图1),推测其主要是由于几丁质酶需求的降低所致,由于高海拔区甲壳类动物或甲壳类物质分布较少。

表3 冗余分析中影响因子的解释率

除了温度和含水率,MBC是影响SON解聚酶重要的因素之一(图4)。众所周知,土壤中的解聚酶主要是由细菌、真菌等土壤微生物分泌,微生物生物量的变化必然会影响土壤SON解聚酶的分泌量,进而影响SON的解聚作用[13]。土壤微生物对环境变化十分敏感[36],近期一项全球尺度的meta分析表明,热带和亚热带地区土壤微生物生物量随海拔升高而增加,与土壤有机碳和全氮浓度呈显著正相关[15]。本研究中MBC和MBN随海拔升高而增加,MBC随海拔升高呈波浪式增长,在海拔1600 m和2000 m达到波峰值,并显著高于其他海拔(P<0.05,表2),这将有利于SON解聚酶的分泌。由于ALPT、NPT、Lac和LAP与土壤ST、SM以及MBC最为密切,与ST呈显著负相关,与SM、MBC呈显著正相关(图3,图4)。这直接导致了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、漆酶和亮氨酸氨基肽酶4种解聚酶活性随海拔升高逐渐增加的分布规律,并在海拔2000 m显著增加(图1)。

此外,多数研究表明土壤pH值会影响土壤酶活性[14, 33, 37]。在本研究中尽管土壤pH在海拔1800 m显著升高(表2),并与部分SON解聚酶存在显著的相关性(图3)。但相比于其他因素,土壤pH值对SON解聚酶的解释率很低(表3)。可能原因在于长期的环境塑造下,酶产生了功能性适应[37]。Puissant等[37]最近的一项研究表明,亮氨酸氨基肽酶活性的最佳pH值接近天然土壤pH值,酶的最适pH值会向源土壤pH值方向移动。本研究也发现,亮氨酸氨基肽酶与pH没有显著的相关性(图3)。Luo等[38]在北京缙云山350—500 m海拔梯度马尾松的研究同样发现,土壤酶活性对温度和含水率更敏感,与土壤pH无密切联系。

3.2 不同海拔梯度下有机底物和矿质氮对黄山松SON解聚酶活性的影响

图5 海拔梯度对黄山松SON解聚酶活性的影响示意图

4 结论

SON解聚酶活性在不同海拔梯度下受多种因素的综合影响,其中温度和含水率是影响SON解聚酶活性两大最重要的因素。尽管温度对SON解聚酶活性的负效应大于含水率对SON解聚酶活性的正效应,但是其他因素,如微生物生物量碳、矿质氮含量同样对SON解聚酶活性有很强的正效应,因此不同海拔梯度下环境因子累计的正效应大于负效应。相比于有机底物,下游无机氮循环中矿质氮对SON解聚酶活性产生了重要的影响。当矿质氮缺乏时,没有刺激酶的生产,反而降低了酶活性,尽管这不符合微生物代谢的经济学理论,但表明了在亚热带中、高海拔区SON解聚酶合成容易受到有效氮资源的限制。

致谢：感谢曾嘉鸿对本文写作的帮助。