天香丹抑制血小板聚集改善颈动脉血栓形成的作用研究

何 欢，张亚洁，吴丹丹，谢晓柳，辛锦钰，古丽葛娜·萨吾尔，安冬青,3

（1新疆医科大学中医学院；2新疆医科大学附属中医医院；3新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐 830011）

动脉血栓是动脉粥样硬化性心脏病及脑卒中等心脑血管疾病的主要病理基础，血小板过度活化、聚集是血栓形成的主要原因[1]。当血管受损时，静息在血管中的血小板活化后游移到血管受损部位黏附、聚集形成血栓，以修复血管。当血小板大量活化、聚集时，会加速血栓性疾病的形成和发展[2-3]。动脉血栓形成栓子并脱落，轻则导致局部供血障碍，重则栓塞至心脑肺部等重要器官影响供血供氧，造成严重的后果。因此抑制血小板过度活化、聚集对于抗血栓防治心血管疾病有着非常重要的意义[4]。目前认为使用抗血小板药物是治疗动脉血栓性疾病的有效手段，但临床常用抗血小板药物（如阿司匹林、氯毗格雷等）长期应用时会存在如药物抵抗，加出血风险等不良反应[5-6]，因此寻找安全有效的抗血小板药物是迫切需要解决的问题。天香丹是新疆医科大学附属中医医院治疗冠心病的经验方，由新疆特色药材芳香新塔花、红景天、丹参和降香4味药物组成，具有补气活血、芳香开泄的功效。课题组前期研究表明天香丹能提高SOD 的活性和GSH 含量，增强细胞自由基清除力，可有效遏制外源性氧化剂对血管内皮细胞的损伤[7]，改善冠脉微循环障碍中的冠脉微血栓[8]。本研究采用FeCl3建立小鼠颈动脉血栓的模型，探究天香丹抗血小板聚集抑制血栓形成的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，购买于新疆医科大学北校区动物实验中心，体质量(22±2)g，饲养于屏障环境中。动物许可证号:SYXK(新)2018-0003。本实验通过新疆医科大学北校区动物实验中心实验动物伦理委员会批准(批号ACUC20201110-14)。

1.2 试药天香丹颗粒（新疆医科大学附属中医医院中药房制备，9 g/包，批号191170）；阿司匹林肠溶片（神威药业集团有限公司,25 mg/片，批号2009152）；三氯化铁(FeCl3，天津市鑫铂特化工有限公司，批号20201009)；二磷酸腺苷（ADP，美国Sigma-Aldrich公司，批号A2754）。

1.3 仪器Vevo3100 小动物超声成像平台（富士VisualSonics 公司）；EG1150 型组织包埋机(德国Leica公司),RM2235 型切片机(德国Leica 公司)；MULTISKANGO酶标仪（美国赛默飞公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药方法 将40 只小鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、天香丹组和阿司匹林组，每组10 只。实验小鼠用药剂量换算公式[（g·kg-1·d-1）]＝9.1×成人临床常药量（g·kg-1·d-1）计算，天香丹组与阿司匹林组给药量分别为2.7 g·kg-1·d-1、11.4 mg·kg-1·d-1，其余2组给予等体积的蒸馏水，灌胃体积0.2 mL/10 g体质量定时灌胃1次，药物用蒸馏水当日配制，连续灌胃21 d。

1.4.2 20%FeCl3诱导左颈总动脉血栓形成模型的建立方法[9]末次给药1 h 后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定，小鼠颈部区域使用脱毛膏进行脱毛处理，无菌手术分离左侧颈总动脉，暴露长约5 mm 的左侧颈总动脉，在其动脉下放置石蜡薄膜(5 mm×5 mm)，避免周围血管组织被FeCl3影响，随后在左侧颈总动脉上敷含有20%FeCl3溶液的滤纸(4 mm×4 mm)10 min(假手术组敷上蘸有生理盐水的滤纸片)，10 min 后去除滤纸片，用生理盐水清洗后缝合颈部皮肤，随后进行检测。

1.5 指标的测定

1.5.1 超声检测颈动脉血栓形成情况 小鼠麻醉后，将其仰卧位固定在检测台上，采用Vevo3100 小动物超声影像系统，选择40 MHz 电子线阵超声探头，BModel 模式于造模前和造模后观察小鼠左侧颈总动脉内膜和管腔情况，并记录。超声检测由专业的超声科老师进行操作，且每只检测时间控制在30 min以内。

1.5.2 剪尾实验检测小鼠尾出血时间和出血量[10]麻醉状态下将小鼠仰位放置于37℃加热板上，用75%酒精擦拭鼠尾，在尾部3 mm 处作一横切口，快速将鼠尾放入37 ℃的温盐水中，血液自然流出，开始计时，出血时间为鼠尾第一滴血出来的时间到出血停止的时间。通过比色法测定生理盐水内蛋白量，计算各组小鼠出血量。

1.5.3 酶标仪检测ADP 诱导的血小板聚集率[11]采用心尖取血的方法，将全血与3.2%枸橼酸钠抗凝按9∶1比例轻轻混合。4℃冰箱内静置30 min，1 290 r/min离心6 min；取上清液为富血小板血浆（PRP）；继续以2 360 r/min 离心10 min 后，取上层液至另一洁净离心管中，为贫血小板血浆(PPP)。使用PPP 调整PRP 中血小板数目为3×108个/mL。各组分别取150 μLPRP加入在96 孔板中，在490 nm 波长下使用酶标仪测得OD 值，然后各孔再分别加入10 μL ADP 溶液（终浓度为10 μmol/L)，另设一组加入空白溶剂10 μL 作为空白组，振荡摇床里孵育6 min后，MULTISKANGO 酶标仪上测OD 值，计算各组血小板聚集率%=（1-加入ADP前的OD值/加入ADP后的OD值）×100%，每组设3个平行样本。

1.5.4 HE 染色观察左颈总动脉血栓形成的病理变化 小鼠处死后分离左颈总动脉，使用纱布包裹，避免动脉漏出包埋盒。4%多聚甲醛固定36 h 后，常规脱水透明、石蜡包埋、切片(4 μm)、HE 染色、中性树胶封片，光镜下观察各组血栓形成病理情况。

1.6 统计学处理采用SPSS 26.0统计学软件分进行统计析，计量资料以()表示，统计推断采用ANOVA分析，LSD 检验进行多重比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天香丹对20%FeCl3诱导的小鼠左颈总动脉血栓形成的影响造模前各组小鼠左侧颈总动脉血管超声为正常血管超声图像。使用vevolab 血管舒张期末截取的静态图像中可观察到各组小鼠左侧颈总动脉血管走行正常，血管腔内透声良好，内膜光滑，未见明显异常回声（图1-A），造模前各组小鼠左侧颈总动脉血管管腔未见明显差异（P＞0.05），（见图1-C）。造模后假手术组超声图像显示小鼠左侧颈总动脉血管正常光滑，走行正常，血管内径未见明显狭窄；模型组可见小鼠左侧颈总动脉血管管径狭窄，内中膜不规则明显增厚，动脉膨大处分别探及多个低回声，后方声影不明显。天香丹组和阿司匹林组显示小鼠左侧颈总动脉血管欠光滑，走行正常，内膜增厚，血管内径稍狭窄，管腔内未见明显血栓形成（图1-B）。造模后各组左侧颈总动脉血管管径差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，天香丹组小鼠左侧颈总动脉血管管腔狭窄程度减小，差异有统计学意义（P＜0.05），（见图1-D）。

图1 20%FeCl3诱导左颈总动脉血栓形成超声图以及血管管径统计图

2.2 天香丹降低小鼠剪尾出血时间和出血量与模型 组比较，天香丹组出血时间和出血量差异无统计学意义(P＞0.05)；与模型组比较，阿司匹林组出血时间延长出血量增大，差异有统计学意义(P＜0.05)；与阿司匹林组比较，天香丹组出血时间和出血量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠剪尾出血时间和出血量的比较（,n=10）

表1 各组小鼠剪尾出血时间和出血量的比较（,n=10）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＞0.05；与阿司匹林组比较，※P＜0.05。

2.3 天香丹抑制颈动脉血栓模型小鼠血小板聚集率与模型组比较，天香丹组和阿司匹林组均可抑制10 μmol/L ADP 诱导的血小板聚集，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 各组小鼠10 μmol/L ADP刺激的血小板聚集率

2.4 天香丹对小鼠左侧颈总动脉血栓形成病理状态的改善假手术组小鼠颈动脉未见有血栓形成，内皮结构完整，可见深染内皮细胞核，中膜、外膜结构完整，未见病变，无剥落和脱离现象；模型组小鼠血管内有血栓形成，血栓连续、紧密，大面积阻塞血管，血管内皮损伤严重，中、外膜结构不完整，部分出现剥落。天香丹组与阿司匹林组小鼠血栓形成明显减轻，管腔内部分血栓溶解，血管内皮损伤明显减轻，内皮结构较完整连续，中、外膜损伤明显减轻，偶见部分剥离、碎裂，见图3。

图3 各组小鼠左颈总动脉血栓形成图

3 讨论

心血管疾病患者中约有50%的死亡是由于血栓形成而导致的[2]，预防血栓形成和血栓形成后的治疗对于降低心血管疾病死亡率非常重要。动脉血栓的形成大多是在动脉粥样硬化的基础上形成。血管内皮细胞受损破裂时，导致血小板黏附、聚集，局部积蓄有效浓度的凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变成纤维蛋白而形成血栓[12]。本研究利用FeCl3的化学氧化作用建立血栓动物模型，其形成的血栓结构与人类自发形成的血栓结构相类似[13]。

本研究采用小动物超声系统检测血栓形成的情况，小动物超声系统对于在体微小结构检测，如小鼠心脏血流、血管形态及斑块等检测中是一个可靠的检测方法[14]。研究发现模型组造模后管腔狭窄严重，结合文献及本研究结果，其原因是FeCl3参与氧自由基生成，损伤动脉内膜，随后内皮下基质暴露于血管中，诱导血小板聚集，激活凝血系统，导致血栓形成，造成管腔狭窄[15]。本研究表明天香丹及阿司匹林可有效改善血栓形成管腔狭窄的情况。ADP 是研究血小板聚集反应常用的诱导剂，属生理性诱导剂。ADP通常是由血小板内的致密颗粒所释放，当使用大于或等于5 μmol/L 以上浓度的ADP 刺激血小板时，血小板的形状会快速发生改变，从而发生血小板聚集反应[16]。研究结果表明，与模型组比较，天香丹组和阿司匹林组均可以显著抑制ADP 诱导的血小板聚集率，且天香丹组和阿司匹林组的血小板聚集率差异无统计学意义，可以推测出天香丹在抑制血小板聚集方面的功效与阿司匹林相似。剪尾实验对于凝血药物筛选和评价非常重要，能够有效评价药物的止血效果[10]。FeCl3诱导的颈动脉血栓模型组剪尾实验出血时间减短，出血量减少,提示小鼠机体处于高凝状态,而使用天香丹和阿司匹林处理可延长凝血时间。血小板的聚集功能对于机体止血功能具有非常重要的作用，当血小板聚集率受到抑制时，止血功能也会受到一定的影响。本研究提示天香丹可通过抑制血小板聚集抑制FeCl3诱导的血栓形成。但与阿司匹林组比较，天香丹组出血量明显减少，说明天香丹在降低血小板聚集、抑制血栓形成的同时，对出血时间和出血量的影响不明显，安全性较高。

血栓形成与中医的血瘀证在生理病理认识方面非常相似，益气活血法是中医临床治疗血瘀证的有效方法[17]。国内外多项研究表明，活血化瘀类中药单体、复方及中成药可以通过抗血小板聚集、改善血液流变学、凝血功能起到抗栓作用[18-24]。天香丹为“通补开泄法”治疗冠心病的代表方，具有补气活血的功效。前期研究表明，天香丹可调节血浆血栓素（TXB2）、前列环素（6-Keto-PGF1α）水平减少血栓形成[25]。本研究为天香丹在改善血小板功能，预防血栓等心血管疾病的应用提供了实验依据。