五倍子提取物对1～42日龄黄羽肉鸡生长性能、肠道形态、免疫功能、抗氧化能力及肠道菌群的影响

2022-03-30范秋丽陈志龙林泽铃茅沈丽蒋守群

动物营养学报 2022年3期

范秋丽陈志龙林泽铃张盛茅沈丽蒋守群

(广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州510640)

随着国内禁止使用促生长类抗生素以来，抗生素替代品在畜牧养殖中的研究也受到越来越广泛的关注，包括对五倍子提取物的研究。五倍子是蚜虫寄生在漆树科盐肤木属植物叶柄或叶子上所形成的虫瘿，我国五倍子产量约占世界总产量的95%，产量高且品质优，五倍子提取物的主要成分之一为没食子酸，其占总提取物的2%～4%[1]。前人研究表明，作为一种有机酚酸，没食子酸具有抑菌、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等生物活性。添加250 μg/mL没食子酸可降低变形链球菌生物活性、减少胞外多糖含量以及微菌落数量[2]；添加300 mg/mL没食子酸可下调丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白表达水平，减少活性氧(ROS)的产生[3]；添加0.05～0.20 g/kg没食子酸可减少在4 ℃冷藏了9 d的猪肉糜中硫代巴比妥酸(TBARs)值，抑制羰基化合物的生成和表面疏水性的增加[4]；口服50 mg/kg体重的没食子酸可消除N-亚硝基-二乙胺对小鼠肝脏的致癌作用[5]。没食子酸已被证明可提高畜禽产品品质，降低有害气体排放。22～36日龄肉鸡饲粮添加1%的没食子酸可提高胸肌持水力以及多不饱和脂肪酸花生四稀酸和二十二碳六烯酸含量，同时提高腿肌中亚油酸和二十二碳六烯酸含量[6-7]；饲粮添加1.5%没食子酸可减少42日龄肉牛甲烷的排放量[8]。近年来，黄羽肉鸡年出栏量达40亿只，约占肉鸡总出栏量的40%[9]。目前，没食子酸在黄羽肉鸡上的应用研究报道很少，且没食子酸在调节肉鸡免疫功能和改善肠道微生物菌群结构方面尚无报道。因此，本试验以1～42日龄新广901肉鸡为对象，研究了饲粮添加不同水平五倍子提取物对其生长性能、肠道形态、免疫功能、抗氧化能力及盲肠菌群结构的影响，为五倍子提取物替代抗生素在黄羽肉鸡健康养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1日龄雏鸡购自佛山市高明区新广农牧有限公司；恩拉霉素(纯度98%)购自山东某兽药有限公司；五倍子提取物购自某生物科技股份有限公司，有效成分含量为4%的没食子酸(无其他活性成分)，以二氧化硅为载体。

1.2 试验设计

选择600只初始体重为(39.75±0.02) g且健康状况良好的1日龄新广901肉公雏，根据体重一致原则随机分为4个组，每组6个重复，每个重复25只。对照组饲喂基础饲粮，抗生素组在基础饲粮中添加2 mg/kg恩拉霉素，五倍子1组在基础饲粮中添加250 mg/kg五倍子提取物，五倍子2组在基础饲粮中添加500 mg/kg五倍子提取物。试验分1～21日龄和22～42日龄2个阶段饲养，试验期42 d。

1.3 试验饲粮

试验采用玉米-豆粕-杂粕型基础饲粮，根据《中国饲料成分及营养价值表》(2019年第30版)和《黄羽肉鸡营养需要量》(NY/T 3645—2020)配制，各组营养水平保持一致，恩拉霉素和五倍子提取物按照不同添加水平等重量替代预混料中的统糠。

1.4 饲养管理

试验在广东省农业科学院动物科学研究所内的封闭式鸡舍开展，地面铺放谷壳，试验鸡自由采食颗粒料和饮水，各组饲养管理和环境条件一致，每天自然光照和通风。按照常规操作程序和免疫流程进行饲养和免疫，每天06:00、12:00、18:00记录鸡舍温度和相对湿度。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目Items1～21日龄1 to 21 days of age22～42日龄22 to 42 days of age粗蛋白质 CP21.5019.50赖氨酸 Lys1.291.15蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.930.85钙 Ca1.000.92总磷 TP0.740.67有效磷 AP 0.470.41

1.5 样品采集与制备

试验结束时每个重复选取接近平均重的2只鸡颈部放血致死，剖取空肠和回肠，各肠段取中间1 cm处分别固定于4%的多聚甲醛溶液中，备测空肠和回肠形态指标。剩余空肠和回肠剪取中间部位约1 g装于灭菌的1.5 mL离心管中，标记后立即置于液氮中保存，备测空肠和回肠生化指标以及相关基因表达量。收集盲肠食糜于灭菌的10 mL离心管中，标记后立即置于液氮保存，备测菌群结构。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 生长性能

试验各阶段结束前1天20：00断料供水，次日08：00以重复为单位称重，统计耗料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)以及死亡率。

1.6.2 肠道形态

空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度值的具体测定方法参考范秋丽等[10]。

1.6.3 肠道生化指标

分别剪取冻存的空肠和回肠样品100 mg左右于灭菌的2 mL离心管中(离心管中含有2颗直径为0.3 mm的镐珠)，按照组织样品重量(mg)∶生理盐水体积(μL)=1∶9的比在研磨仪(JXFSTPRP-CL，上海净信实业发展有限公司)上匀浆(50 Hz，120 s，4 ℃)，匀浆后的样品3 000×g离心10 min取上清即为10%空肠、回肠匀浆液，可直接用于测定生化指标。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒测定空肠、回肠总蛋白含量，试剂盒购买于赛默飞世尔科技(上海)有限公司。双抗夹心法测定空肠、回肠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)含量，以上免疫指标试剂盒均购买于上海麦莎生物科技有限公司。丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性等抗氧化指标具体测定方法参考范秋丽等[10]所述方法。

以上总蛋白含量以及免疫、抗氧化相关指标的测定均在多功能酶标仪(SYNERGY H1，BioTek公司，美国)上读数，测定方法和结果计算严格按照试剂盒说明书上的步骤操作。

1.6.4 肠道紧密连接和抗氧化相关基因表达

分别剪取100 mg空肠、回肠样品于2 mL无RNase离心管中，每管加入1 mL Trizol试剂(北京艾德莱生物科技有限公司)提取总RNA，提取方法严格按照说明书操作步骤进行。提取的RNA在核酸浓度测定仪(NanoDrop One，Thermo Fisher，美国)上测定各样品浓度，然后根据cDNA反转录试剂盒(TaKaRa，RR047，日本)说明书取用1 μg进行反转录。使用Primer Premier 3.0引物设计软件按照GenBank中鸡的基因引物序列(表2)设计所需全部引物。相对荧光定量PCR(RT-qPCR)反应体系由10倍稀释的cDNA 2 μL，SYBR Green 2×Mix 10 μL，浓度为100 nmol/L的上游引物工作液各1 μL和ddH2O 6 μL组成，总体积为20 μL。体系反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，退火温度条件下退火30 s，72 ℃延伸30 s，变性至延伸步骤重复进行40个循环。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.6.5 肠道菌群

使用粪便基因组DNA提取试剂盒(D3146-02，Magen公司，美国)提取盲肠内容物细菌总DNA，核酸浓度测定仪(ND-1000，NanoDrop公司，美国)测定DNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。用带Barcode的特异引物341F(5’-CCTACGGGRBGCASCAG-3’)和806 R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)对细菌16S rDNA V3～V4可变区进行PCR扩增，2%琼脂肪凝胶电泳检测扩增产物，AxyprepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司，美国)切胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司，美国)进行定量检测，Illumina PE250文库构建和测序，本试验测序由上海凌恩生物科技有限公司完成。

测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，应用Uparse v7.0.1001软件将有效数据以97%的同源性聚类成操作分类单元(OTUs)，将OTUs序列和Silva 32数据库比对并用Mothur方法进行物种注释分析，获得分类学信息并在属水平分析各组盲肠微生物菌群结构。

1.7 数据统计分析

试验数据采用SAS 9.5软件中的GLM程序进行单因素方差分析，当处理效应差异显著时进行Duncan氏多重比较，P<0.05为差异显著性判断标准，试验结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。

2 结果

2.1 五倍子提取物对1～42日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

由表3可知，肉鸡各阶段生长性能已达到该品种正常水平。1～21日龄，与对照组相比，抗生素组、五倍子1组和五倍子2组21日龄体重、平均日增重、平均日采食量、料重比和死亡率均无显著差异(P>0.05)。22～42日龄，与对照组相比，抗生素组42日龄体重和平均日增重分别显著升高8.23%和10.67%(P<0.05)，五倍子2组42日龄体重和平均日增重分别升高3.93%和3.52%(P>0.05)。1～42日龄，与对照组相比，抗生素组平均日增重显著升高8.51%(P<0.05)，五倍子2组平均日增重升高4.05%(P>0.05)。

表3 五倍子提取物对1～42日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

2.2 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道形态的影响

由表4可知，与对照组相比，抗生素组、五倍子1组和五倍子2组空肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度值均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，五倍子2组回肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度值均显著升高(P<0.05)；且五倍子2组绒毛高度/隐窝深度值显著高于抗生素组(P<0.05)。

表4 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道形态的影响

2.3 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道免疫功能的影响

由表5可知，与对照组相比，五倍子1组和五倍子2组空肠sIgA含量均显著升高(P<0.05)；且五倍子2组空肠sIgA含量显著高于抗生素组(P<0.05)。与对照组相比，五倍子1组和五倍子2组空肠IL-8含量均显著降低(P<0.05)，抗生素组、五倍子1组和五倍子2组空肠TNF-α含量均显著降低(P<0.05)；且五倍子2组空肠TNF-α含量显著低于抗生素组(P<0.05)。与对照组相比，抗生素组、五倍子1组和五倍子2组空肠IFN-γ含量显著升高(P<0.05)。各组之间回肠sIgA、IL-1β、IL-8、TNF-α和IFN-γ含量均无显著差异(P>0.05)。

表5 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道免疫功能的影响

2.4 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道抗氧化能力的影响

由表6可知，各组之间空肠MDA含量、T-AOC及T-SOD和GSH-Px活性均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，抗生素组、五倍子1组和五倍子2组回肠MDA含量显著降低(P<0.05)，回肠T-SOD活性显著升高(P<0.05)。各组之间回肠T-AOC和GSH-Px活性均无显著差异(P>0.05)。

表6 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道抗氧化能力的影响

2.5 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道紧密连接和抗氧化相关基因表达的影响

由表7可知，各组之间空肠闭合小环蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白1(Claudin1)和核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，五倍子2组回肠ZO-1和Nrf2 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)；且五倍子2组回肠ZO-1和Nrf2 mRNA相对表达量显著高于抗生素组(P<0.05)。

表7 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道紧密连接和抗氧化相关基因表达的影响

2.6 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道菌群的影响

本试验共对48个肉鸡盲肠食糜样品以97%的序列相似性经16S rRNA进行了测序，共得到2 179 510个有效序列，平均每个样品有45 406个序列，聚类生成3 119个OTUs。表8为属水平下相对丰度大于1%的盲肠微生物属优势菌群，与对照组相比，抗生素组、五倍子1组和五倍子2组盲肠另枝菌属(Alistipes)相对丰度显著降低(P<0.05)，且五倍子2组盲肠Alistipes相对丰度显著低于抗生素组(P<0.05)。与对照组相比，五倍子1组和五倍子2组盲肠芽孢杆菌属(Bacillus)和毛螺菌属(Lachnospira)相对丰度均显著升高(P<0.05)，五倍子2组盲肠瘤胃球菌属(Ruminococcus)相对丰度显著升高(P<0.05)，五倍子1组和五倍子2组盲肠理研菌属(Rikenella)相对丰度显著降低(P<0.05)。

表8 盲肠微生物属水平下的优势菌群相对丰度

3 讨论

3.1 五倍子提取物对1～42日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

酚类化合物和酸化剂已被证明在提高肉鸡生长性能方面具有显著的效果[11-12]。Samuel等[13]研究表明，饲粮添加25～150 mg/kg没食子酸(纯度≥90%)对1～42日龄爱拔益加(AA)肉鸡1～21日龄、22～42日龄以及1～42日龄平均日增重和平均日采食量均无显著影响，但饲粮添加75～100 mg/kg没食子酸可降低1～21日龄、22～42日龄以及1～42日龄料重比，提高饲料利用效率。Mašek等[14]研究表明，饲粮添加5 g/kg没食子酸(购自Sigma-Aldrich公司，产品信息不明)对1～35日龄罗斯308肉鸡体重和平均日增重均无显著影响，但可降低料重比。本试验结果显示，虽然饲粮添加250和500 mg/kg五倍子提取物对黄羽肉鸡1～21日龄、22～42日龄以及1～42日龄平均日采食量和料重比均无显著影响，但饲粮添加500 mg/kg五倍子提取物有提高22～42日龄以及1～42日龄平均日增重的趋势。这说明五倍子提取物在提高1～42日龄黄羽肉鸡生长性能方面具有一定的开发潜力，不同研究结果可能与产提取工艺和纯度不同有关。

3.2 五倍子提取物对42日龄黄羽肉鸡肠道形态和屏障功能的影响

空肠和回肠是养分吸收的主要区域，其绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度值可用来作为间接衡量饲料转化效率的指标[15]。绒毛高度增加、隐窝深度降低、绒毛高度/隐窝深度值增加说明肠道可更好地吸收营养物质[16]。本试验结果显示，饲粮添加500 mg/kg五倍子提取物可显著增加回肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度值，且绒毛高度/隐窝深度值显著高于抗生素组。Samuel等[13]研究发现，饲粮添加50～100 mg/kg没食子酸提高了1～42日龄AA肉鸡空肠绒毛高度/隐窝深度值，饲粮添加25～150 mg/kg没食子酸对空肠绒毛高度无显著影响，与本试验结果一致。外周胞浆蛋白ZO-1和Claudin1参与家禽肠道紧密连接的形成，在肠道机械屏障中发挥着关键的作用[17]。研究表明，酚酸类化合物的添加可显著上调肠道紧密连接相关基因ZO-1和Claudin1的mRNA相对表达量，从而改善屏障功能[18-19]。本研究结果显示，饲粮添加500 mg/kg五倍子提取物可显著上调回肠ZO-1 mRNA相对表达量，且显著高于抗生素组。以上结果说明，饲粮添加500 mg/kg五倍子提取物可改善42日龄黄羽肉鸡肠道形态和屏障功能。

3.3 五倍子提取物对42日龄肉鸡免疫功能的影响

没食子酸对免疫功能的调节主要体现在抗炎方面，Tanaka等[20-21]研究发现，没食子酸不仅可抑制脂肪细胞和巨噬细胞相互作用引起的脂肪细胞肥大和炎症反应，还可抑制肝细胞和巨噬相互作用引起的肝脂质积聚、细胞凋亡和炎症反应。Zhu等[22]研究表明，没食子酸可通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路在溃疡性结肠炎中发挥抗炎作用。肠道sIgA含量以及促炎和抗炎等细胞因子含量可在一定程度上反映机体免疫功能高低，sIgA和IFN-γ含量升高，IL-1β、IL-8和TNF-α等促炎因子含量降低，说明机体免疫功能增强[23-24]。本研究结果显示，饲粮添加250和500 mg/kg五倍子提取物可显著提高空肠sIgA和IFN-γ含量，同时显著降低空肠IL-1β和IL-8含量。此结果与黄丽华等[25]应用没食子酸降低脂多糖(LPS)应激巨噬细胞胞内IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子含量的结果相似。这说明饲粮添加250和500 mg/kg五倍子提取物可通过提高免疫球蛋白含量和降促低炎症细胞因子含量提高42日龄黄羽肉鸡免疫功能。

3.4 五倍子提取物对42日龄肉鸡抗氧化能力的影响

没食子酸因分子结构中具有芳香环和羟基，可有效地通过提高电子转移效率下调活性氧代谢，同时酚羟基与自由基发生抽氢反应达到抗氧化的作用[26]。血液和肠道MDA含量、T-AOC以及T-SOD、GSH-Px活性是用来衡量机体抗氧化能力强弱的常用指标。Samuel等[13]研究表明，饲粮添加100 mg/kg没食子酸可显著降低42日龄AA肉鸡血浆中MDA含量。本研究结果显示，饲粮添加250和500 mg/kg五倍子提取物可显著降低42日龄肉鸡回肠MDA含量，此结果与前人研究结果一致。本研究结果还显示，饲粮添加250和500 mg/kg五倍子提取物可显著提高回肠T-SOD活性，此结果与Pazhanivel等[27]使用酚类化合物姜黄素在提高肉鸡血清中T-SOD活性的结果相似。这说明没食子酸的添加可通过降低脂质过氧化物含量和提高抗氧化酶活性达到提高42日龄黄羽肉鸡抗氧化能力的目的。Nrf2是机体中重要的内源性保护分子，是抗氧化应激最重要的转录因子之一。姜春晖等[28]研究表明，酚类化合物姜黄素可通过增加奶牛乳腺上皮细胞Nrf2的表达，激活下游抗氧化分子的转录而缓解过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激。本研究结果显示，饲粮添加500 mg/kg五倍子提取物可显著上调回肠Nrf2 mRNA相对表达量，说明没食子酸可通过激活Nrf2信号通路提高肉鸡抗氧化能力，具体信号通路相关分子的研究将在后续试验验证。

3.5 五倍子提取物对42日龄肉鸡肠道菌群的影响

肠道微生物可参与宿主体内碳水化合物和脂肪等营养素的吸收和代谢、不可消化膳食纤维的发酵、某些维生素的合成等生理过程，同时，肠道微生物还可通过与宿主胃肠道内壁相互作用而调节免疫功能[29-30]。因此，研究肠道微生物的组成和平衡对保持机体的健康至关重要。Alistipes是拟杆菌门细菌中的一种，其与肠道炎症和脓肿相关[31]；Bacillus类细菌可产生抵抗不利环境条件的特殊芽孢[32]；Lachnospira是毛螺菌科细菌中的一种，可参与机体内碳水化合物的发酵，为机体提供能量[33]；Ruminococcus是降解纤维素的优势菌属，可降解纤维素为机体提供能量[34]；肠道内Rikenella类细菌的升高可能与抑郁密切相关[35]。本研究结果显示，饲粮添加250和500 mg/kg五倍子提取物可显著降低盲肠Alistipes和Rikenella相对丰度，显著提高盲肠Bacillus和Lachnospira相对丰度，同时，饲粮添加500 mg/kg五倍子提取物可显著提高盲肠Ruminococcus相对丰度。此结果与王一冰[36]应用300 mg/kg酚酸类化合物原儿茶酸降低52日龄黄羽肉鸡盲肠内容物中有害微生物拟杆菌门和变形菌门相对丰度，同时升高有益微生物厚壁菌门相对丰度的研究结果相似。这说明没食子酸可通过降低有害微生物和升高有益微生物水平改善肠道健康。