小檗碱齐墩果酸盐对仔猪生长性能、血清生化指标和肠道健康的影响

2022-03-30包学太黎育颖田军权苏文璇

动物营养学报 2022年3期

包学太黎育颖田军权苏文璇杨凡姚康

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所，动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心，长沙410125；2.中国科学院大学，北京100049)

仔猪的断奶过渡期是整个生猪养殖过程的关键环节之一，将直接影响到养猪业的整体经济效益[1-2]。断奶应激导致仔猪胃肠道消化酶分泌不足，再加上消化道自身的偏碱性环境，导致仔猪肠道极易感染病原菌和病毒，造成断奶仔猪腹泻[3]。腹泻导致断奶仔猪生长发育缓慢，死亡率提高，造成严重的经济损失。过去很长一段时间，畜禽生产过程中使用抗生素来维持和促进动物生长，但长期、大量、广泛以及不合理的使用抗生素，导致致病菌抗药性增强，畜产品药物残留严重，这直接危及到人类健康。欧盟在2006年及我国在2020年颁布了相关政策禁止在饲料中添加抗生素，因此寻找绿色、高效和无污染的替抗产品显得尤为重要。

小檗碱，又名黄连素，是一种具有四环结构的异喹啉类生物碱，在许多草药植物的根、根茎和茎皮中含量较高，是存在于亚洲和美洲的各种黄连科和小檗属植物中的重要活性成分[4-5]。据药理研究发现，小檗碱对多种病原微生物具有抑制和杀灭作用，其抑菌机制主要是作用于细胞膜，破坏菌体结构，致使菌体细胞破裂，胞内离子外流[6]。同时，小檗碱还能抑制细菌RNA转录、蛋白质及脂质合成，从而发挥抑菌作用[7-8]。此外，小檗碱在抗肿瘤[9-10]、抗氧化[11]和治疗糖尿病[12]等方面应用也较为广泛。齐墩果酸，又名庆四素，是从女贞子、甘草等植物中分离提取的一种五环三萜类化合物，是女贞子中的主要有效成分[13]。齐墩果酸具有护肝降酶的作用，常用于治疗急性肝炎[14]。同时，齐墩果酸被机体吸收后还具有抗炎[15-16]、抗肿瘤[17-18]和抗氧化[19]等药理作用。但是，小檗碱和齐墩果酸的单一成分均难溶于水，有着吸收差的特点，再加上小檗碱味道极苦可能会影响饲粮的适口性，这就限制了它们作用于动物机体所发挥的功效。基于此，我们根据小檗碱和齐墩果酸盐的化学特性构建了一种化合物——小檗碱齐墩果酸盐，其化学结构见图1。这不仅解决了小檗碱味苦的问题，而且这种化合物具有亲脂性，可以增加透膜吸收，从而克服了小檗碱和齐墩果酸盐单一成分吸收差的问题。虽然小檗碱齐墩果酸盐克服了小檗碱和齐墩果酸单一成分的缺点，但其在预防和治疗仔猪腹泻方面的研究尚未见报道。研究表明，产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是导致仔猪腹泻的最常见的一类致病菌，其中K88菌株是引起仔猪腹泻的主要病原菌，多用于构建仔猪腹泻模型[20-22]。因此，本试验采用灌服一定量的ETEC K88来建立仔猪腹泻模型，模拟实践生产中大肠杆菌导致的断奶仔猪腹泻，并将不同剂量的小檗碱齐墩果酸盐添加到仔猪饲粮中，研究其对断奶仔猪感染ETEC K88后生长性能、腹泻、血清生化指标和肠道健康的影响。

图1 小檗碱齐墩果酸盐化学结构

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用小檗碱齐墩果酸盐由湖南省中医药研究院制备并提供，性质稳定，相对分子质量为792.1，纯度为80%，其余20%为齐墩果酸和硫酸小檗碱的单一成分。本试验所用大肠杆菌购自国家菌种保藏中心的K88冻干粉[编号：VIP(S)24607]，经复苏、传代增菌，最终获得试验所需浓度菌液。

1.2 试验设计和饲养管理

选取28日龄健康的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪50头[体重(8.22±0.98) kg]，随机分为5个组，每组10个重复，每个重复1头猪。5个组分别为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，其中对照组和模型组饲喂基础饲粮，低、中、高剂量组分别饲喂在基础饲粮中添加50、250和500 mg/kg小檗碱齐墩果酸盐的试验饲粮。基础饲粮参照NRC(2012)营养标准配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

本试验在中国科学院亚热带农业生态研究所全封闭动物房饲养间开展，所有试验猪只单栏饲养。试验全程自由采食和饮水，舍内定期打扫卫生及消毒。试验预试期3 d，正试期18 d。在正试期第15天，模型组和低、中、高剂量组仔猪灌服10 mL浓度为2×109CFU/mL的ETEC K88菌液，对照组仔猪灌服相同剂量的无菌LB培养液。

1.3 样本采集

于正试期第18天，所有猪只在禁止采食12 h后，进行前腔静脉采血并屠宰取样。所采血液分装在抗凝管和普通管中各5 mL，用于血常规指标和血清生化指标的测定。采血后所有猪只迅速处死并解剖，分离心脏、肝脏、脾脏和肾脏，称重记录。同时分离空肠、回肠置于冰上，取中段2 cm左右放于装有4%多聚甲醛固定液的50 mL离心管中，用于检测肠道形态结构。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 生长性能

试验期间每天记录各栏采食量，在试验第1、14和18天同一时间空腹称重仔猪重量，最终计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2 腹泻评分

试验期间每天09:00对仔猪的粪便进行评分并记录，评分标准见表2。

表2 仔猪粪便评分标准

1.4.3 脏器指数

屠宰后分离心脏、肝脏、脾脏和肾脏，吸干其表面水分并称重记录，用于计算各器官指数。计算公式如下：

脏器指数(%)=(脏器重/仔猪活体重)×100。

1.4.4 血清生化指标

试验使用普通负压采血管采集血样，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离得到血清后，使用全自动生化分析仪(Cobas c311，罗氏公司)测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性以及补体3(C3)、补体4(C4)、C反应蛋白3(CRPL3)和免疫球蛋白G(IgG)含量。

1.4.5 血常规指标

使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝负压采血管采集血样后，迅速采用全自动血液细胞分析仪(BC-5000VET，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)进行血细胞分类与计数检测，包括白细胞(WBC)、嗜酸性粒细胞(Eos)、中性粒细胞(Neu)、嗜碱性粒细胞(Bas)、淋巴细胞(Lym)、单核细胞(Mon)、红细胞(RBC)数量和血红蛋白(HGB)、平均红细胞血红蛋白(MCH)含量，以及红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度标准差(RDW-SD)、血小板(PLT)数量、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)和血小板体积分布宽度(PDW)等指标。

1.4.6 肠道形态结构

将2～3 cm空肠和回肠组织样品在4%多聚甲醛固定液固定至少24 h，再依次经过梯度酒精脱水、二甲苯透明和石蜡浸蜡包埋，然后采用旋转切片机切取厚度为4 μm的切片，烘干并做好标记。经过脱蜡水化、先后用Harris苏木素和伊红染液染色、脱水，并用中性树胶封片，显微镜镜检。选取组织切片上绒毛完整、走向平直的视野，采用正置光学显微镜(NIKON ECLIPSE CI)观察，并用CaseViewer软件测量空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)值。

1.5 数据统计分析

试验数据均采用Excel 2010软件进行初步归纳整理，然后采用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著的指标则使用Duncan氏法进行多重比较，并使用线性或二次曲线分析检测指标对小檗碱齐墩果酸盐添加剂量的反应。数据以平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪生长性能的影响

由表3可知，第1～14天，即ETEC K88感染前，与模型组相比，中剂量组仔猪ADFI显著升高(P<0.05)。第15～18天，即ETEC K88感染后，各组仔猪末重、ADFI、ADG和F/G之间均无显著差异(P>0.05)。第1～18天，与模型组相比，中剂量组仔猪ADFI显著升高(P<0.05)；高剂量组F/G显著低于模型组和低剂量组(P<0.05)。小檗碱齐墩果酸盐添加组仔猪第14天和第18天体重呈现出剂量效应，且高剂量组高于对照组(P>0.05)。

表3 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪生长性能的影响

续表3项目 Items对照组Control group模型组Model group低剂量组Low dose group中剂量组Mid dose group高剂量组High dose group末重 Final body weight/kg11.58±0.5411.21±0.5011.43±0.8812.04±0.2612.57±0.32平均日采食量 ADFI/kg0.46±0.03ab0.40±0.04b0.44±0.03ab0.51±0.02a0.44±0.03ab平均日增重 ADG/kg0.19±0.030.19±0.030.16±0.040.21±0.020.23±0.02料重比 F/G2.12±0.18ab2.56±0.29a2.65±0.36a2.34±0.23ab1.72±0.14b

2.2 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪粪便评分的影响

由表4可知，第1～14天，各组仔猪粪便评分之间无显著差异(P>0.05)。在感染后24 h，与对照组相比，模型组仔猪粪便评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组仔猪粪便评分明显降低，但差异不显著(P>0.05)。而在感染后48 h，与对照组相比，模型组仔猪粪便评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组仔猪粪便评分显著降低(P<0.05)。在整个试验期，低、中、高剂量组仔猪粪便评分随着添加剂量的增加呈降低趋势(P>0.05)。

表4 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪粪便评分的影响

2.3 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪脏器指数的影响

由表5可知，与对照组和模型组相比，饲粮添加小檗碱齐墩果酸盐对仔猪心脏、肝脏和肾脏指数均无显著影响(P>0.05)；而低剂量组仔猪脾脏指数较中剂量组显著降低了37.50%(P<0.05)，且脾脏指数随着小檗碱齐墩果酸盐添加剂量的增加呈现出先增高后降低，有二次回归趋势(0.05≤P<0.10)。

表5 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪脏器指数的影响

2.4 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪血清生化指标的影响

由表6可知，与模型组相比，低剂量组仔猪血清ALP活性显著降低(P<0.05)，低、中、高剂量组血清C4含量显著升高(P<0.05)，高剂量组血清C3含量显著提高(P<0.05)。仔猪血清AST活性随着小檗碱齐墩果酸盐添加剂量的增加而线性提高(P<0.05)，其他血清生化指标各组间均无显著差异(P>0.05)。

表6 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪血清生化指标的影响

2.5 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪血常规指标的影响

由表7可知，模型组和低剂量组仔猪血液中Lym数量显著低于对照组和中、高剂量组(P<0.05)，并且血液中Eos数量也显著低于中、高剂量组(P<0.05)。与模型组相比，低剂量组仔猪血液中PLT数量显著升高(P<0.05)，对照组血液中PCT显著升高(P<0.05)。与对照组相比，中剂量组血液中PDW显著降低(P<0.05)。各组仔猪其他血常规指标之间均无显著差异(P>0.05)。仔猪血液中RBC数量和HGB含量与小檗碱齐墩果酸盐添加剂量呈线性负相关(P<0.05)。

表7 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪血常规指标的影响

2.6 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪肠道形态结构的影响

由表8可知，高剂量组仔猪空肠绒毛高度显著高于低剂量组(P<0.05)，模型组空肠隐窝深度显著高于其他各组(P<0.05)，对照组空肠V/C值显著高于模型组和低剂量组(P<0.05)；中、高剂量组仔猪回肠绒毛高度显著高于对照组、模型组和低剂量组(P<0.05)，高剂量组回肠V/C值显著高于低剂量组(P<0.05)。仔猪回肠隐窝深度随小檗碱齐墩果酸盐添加剂量的增加呈现先增高后降低趋势(0.05≤P<0.10)。由图2可以看出，模型组仔猪空肠和回肠绒毛萎缩、隐窝增生，有明显的肠上皮细胞及肠腺体坏死；而中、高剂量组空肠和回肠均为完整的绒毛，且隐窝深度低于模型组，视野中可见正常的肠上皮细胞和肠腺体。

表8 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪肠道形态结构的影响

图2 仔猪空肠和回肠苏木精-伊红染色切片

3 讨论

3.1 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪生长性能的影响

仔猪腹泻是仔猪断奶后常见的一种疾病，会严重影响猪只生长性能，导致免疫功能受损，进而增加发病率和死亡率，制约着养猪业的发展[23]。因此，有效预防仔猪腹泻是保证断奶仔猪健康生长发育的重要环节。在禁抗背景下，促进仔猪生长发育、预防和治疗各种疾病需要开发合适的抗生素替代品。其中，小檗碱因具有多种药理作用成为研究热点之一。据研究报道，在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的大鼠结肠炎试验中，盐酸小檗碱可有效缓解结肠炎造成的小鼠体重下降，且50 mg/kg的盐酸小檗碱改善体重减轻效果最为明显[24-25]。在本研究中，ETEC K88感染前，相比于对照组和模型组，低、中、高剂量组仔猪第14天体重均有所提高，提示小檗碱齐墩果酸盐对未感染ETEC K88的仔猪有增重效果。其原因可能是小檗碱齐墩果酸盐被机体吸收后，增强了机体免疫力，提高了仔猪采食量，进而保证了营养物质的消化吸收。而ETEC K88感染后，相比于模型组，低、中、高剂量组仔猪第18天体重同样有所增高，并且呈剂量效应，提示小檗碱齐墩果酸盐较好地缓解了ETEC K88感染导致的仔猪体重减轻。其原因可能是饲粮中的小檗碱齐墩果酸盐到达后肠后能直接作用于病原菌，从而减少了肠毒素的产生，有效缓解了肠黏膜损伤，进而保证仔猪肠道健康及正常生长发育。在整个试验期，中剂量组仔猪ADFI显著高于模型组，高剂量组F/G显著低于模型组，提示小檗碱齐墩果酸盐对仔猪感染ETEC K88造成的炎症有较好的防治作用，保证仔猪更好的采食。综上所述，小檗碱齐墩果酸盐有助于仔猪的生长发育，可有效缓解仔猪感染ETEC K88后的体重减轻。

3.2 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪粪便评分的影响

仔猪腹泻是生猪养殖过程中的一大难题，也是造成养殖场经济损失的一个重要原因，解决好仔猪腹泻问题是挽回生猪养殖经济损失的根源[2]。粪便评分是根据猪只粪便性状成型进行评分，可直接反映仔猪的腹泻状况。本研究中，在ETEC K88感染前，除高剂量组外的其余4组仔猪均存在较为轻微的腹泻，这可能跟养殖试验当时的气温、近窗近门的环境因素等有关。而在ETEC K88感染后24和48 h，模型组仔猪的粪便评分显著高于对照组，提示本试验仔猪腹泻模型建立成功，这一结果与Peng等[26]报道的ETEC K88攻毒后仔猪的粪便评分结果一致。此外，从ETEC K88感染后24和48 h 2次的粪便评分结果比较发现，小檗碱齐墩果酸盐添加组粪便评分随时间变化降低，模型组粪便评分反而稍有增高。其原因可能是小檗碱齐墩果酸盐对于腹泻仔猪有较好的治疗效果，并且随着添加剂量的增加效果越明显。而模型组仔猪在攻毒处理后，ETEC K88造成的仔猪肠道黏膜损伤没能得到缓解，加之仔猪阶段自身免疫力较弱，机体离子失衡，导致腹泻加重。另外，在感染后24和48 h，中、高剂量组粪便评分相等，其原因可能是本研究中250和500 mg/kg 2种添加剂量已经达到小檗碱齐墩果酸盐治疗仔猪腹泻的适宜临界点，且治疗效果不随添加剂量的增加而提高。综上可知，小檗碱齐墩果酸盐在缓解ETEC K88造成的仔猪腹泻方面效果显著，但最适添加剂量还需进一步研究。

3.3 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪脏器指数的影响

脏器指数是动物机体一项重要的生物学特征指标，常用于衡量机体健康状况和相应脏器的功能强弱。其中，脾脏是动物机体最大的免疫器官，脾脏质量与其体质量呈一定的线性关系[27]，脾脏指数可反映机体细胞免疫功能的强弱。肖玉波[28]研究发现，小鼠在接种肿瘤细胞后，脾脏指数显著提高，而与模型组相比，灌胃给药的高剂量小檗碱组并未发现显著差异。在本研究中，与中剂量组相比，低剂量组仔猪脾脏指数降低了37.50%。这可能与低剂量的小檗碱齐墩果酸盐对攻毒仔猪治疗效果不显著，以及灌胃攻毒过程中造成的应激较大，影响采食导致的仔猪体重下降有关。同时，本研究发现，在仔猪饲粮中添加小檗碱齐墩果酸盐对ETEC K88感染仔猪的心脏、肝脏和肾脏的脏器指数无显著影响，这与肖玉波[28]试验结果基本一致。

3.4 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪血清生化指标的影响

动物机体血清生化指标受饲粮营养水平的影响，同时血清生化指标又可以间接反映机体自身的营养水平、生长发育和健康状况。因此，血清生化指标作为动物生产研究中重要指标之一，在评价机体生长发育、预防疾病等方面意义重大[29]。据研究报道，在四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤的试验中，模型组血清ALP活性升高，小檗碱治疗组血清ALP活性降低，提示小檗碱在一定程度上缓解了四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤[30]。Gao等[31]研究发现，齐墩果酸可以缓解由四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠血清中ALP活性的升高。而本研究中低剂量组仔猪血清ALP活性显著低于模型组，提示饲粮中添加50 mg/kg的小檗碱齐墩果酸盐有助于缓解仔猪感染ETEC K88后的肝脏损伤，从而表现出低剂量组血清ALP活性的下降。有研究表明，补体是人和动物体内一组具有酶原活性的球蛋白，是血浆蛋白的组成成分，血清中C3、C4含量可反映机体的免疫水平[32]。Xu等[33]研究发现，50 mg/kg的小檗碱每2周1次添加到团头鲂饲粮中，可显著提高机体血清中C3和C4含量。在本研究中，仔猪血清C3和C4含量由高到低依次为小檗碱添加组、对照组和模型组，提示小檗碱齐墩果酸盐有助于提高仔猪的机体免疫水平，这可能跟小檗碱齐墩果酸盐相对于单一的小檗碱或齐墩果酸更易于被机体吸收，因此发挥协同增效作用，从而增强机体免疫能力有关。

3.5 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪血常规指标的影响

血常规指标可反映动物机体或器官的健康状况、新陈代谢、内外环境平衡以及监测一些早期血液系统疾病，其检测通常包括白细胞、红细胞和血小板3个方面[34-35]。白细胞中的粒细胞可抵御外界病原微生物的侵入，同时还有吞噬异物并产生抗体等作用。本研究结果显示，中、高剂量组仔猪血液中Lym和Eos数量显著高于模型组和低剂量组，提示仔猪在感染ETEC K88后，机体产生大量Lym和Eos参与机体免疫反应，抵御ETEC K88的入侵，吞噬已入侵的病原菌并产生抗体。因此，小檗碱齐墩果酸盐有助于提高机体免疫功能，可以提升机体抵御外界病原微生物的能力。本研究结果还显示，小檗碱齐墩果酸盐对仔猪感染ETEC K88后血液中红细胞相关指标未出现显著影响。PLT、MPV、PDW和PCT可以从整体反映血小板的功能和分布情况，其中PLT和MPV与骨髓造血功能有关，PDW反映血小板之间的体积差异，PCT与血小板数量和体积有关[36]。在本研究中，与模型组相比，低剂量组仔猪血液中PLT数量显著升高；与对照组相比，中剂量组血液中PDW显著降低，提示仔猪在ETEC K88感染后体内骨髓造血功能下降，高剂量的小檗碱齐墩果酸盐有助于恢复攻毒后造血功能。

3.6 小檗碱齐墩果酸盐对仔猪肠道形态结构的影响

肠道是动物的主要消化器官，同时也是抵御外界病原微生物、毒素和致敏大分子的重要屏障[3]。肠道黏膜层的褶皱、绒毛是动物消化道的主要组成部分，在保证营养物质的消化吸收和维持胃肠道稳态中发挥着重要作用[37-38]。研究发现，小檗碱对腹膜透析液造成的大鼠结肠隐窝损伤和肠上皮屏障功能障碍有明显的修复作用，还能改善微绒毛的形态[39]。Zhu等[24]、Zhang等[25]研究也发现，小檗碱对DSS诱导造成的小鼠肠道损伤有一定的治疗效果，相比于模型组，小檗碱组肠道损伤组织学评分显著降低，并且随小檗碱剂量增加评分呈降低趋势。此外，也有研究发现，断奶仔猪进行ETEC K88攻毒后，仔猪空肠绒毛高度和V/C值显著降低[40]。在本研究中，与对照组相比，模型组仔猪空肠隐窝深度显著升高，空肠V/C值显著降低；与模型组相比，低、中、高剂量组空肠隐窝深度显著降低，提示小檗碱齐墩果酸盐可缓解ETEC K88感染造成的仔猪空肠隐窝增深。同时，中、高剂量组回肠绒毛高度高于其他3组，高剂量组回肠V/C值高于低剂量组，提示小檗碱齐墩果酸盐对仔猪感染ETEC K88后回肠绒毛高度的损伤有明显的治疗效果，出现这一结果的一个可能的原因是小檗碱齐墩果酸盐抑制了ETEC K88，从而减少了毒素的产生。并且，在本研究中500 mg/kg剂量的小檗碱齐墩果酸盐效果最好。综上所述，小檗碱齐墩果酸盐可缓解ETEC K88导致的小肠黏膜损伤，改善腹泻仔猪肠道形态结构。