循环肿瘤细胞PD-L1表达在恶性肿瘤中的研究进展

李祖曦，黄显斌，马云涛，詹渭鹏，狐鸣，田宏伟，杨婧

0 引言

恶性肿瘤高死亡率与其发生转移密切相关[1]，因此针对肿瘤转移机制的研究也愈来愈多。近些年，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）及其表面PD-L1的表达成为研究热点。随着对CTC的不断研究，将CTC的概念定义为：由于医疗操作或自发地脱离原发病灶或者转移病灶进入血液循环的肿瘤细胞[2]，是肿瘤复发转移的关键细胞。1869年Asworth最早在转移性癌症患者血液中观察到CTC[3]。Allen等[4]曾提出CTC可以作为单个细胞存在，也可以作为一个细胞簇存在于外周血中，并且循环肿瘤细胞簇在血液循环中似乎有更高的转移潜能和更短的半衰期。绝大多数CTC会在血液循环中死亡，其原因可能与氧化应激、生长因子和细胞因子的缺乏、机体免疫细胞的作用有关，但少部分存活下来的CTC是引起肿瘤复发转移的重要原因[5]。在循环中存活下来的CTC有一部分退出血液开始分裂、定植形成转移灶；另一部分会进入休眠状态，并最终保留成为转移性病变的能力。PD-1是程序性死亡受体-1，多表达于活化后的T细胞表面，而在未活化T细胞上表达不明显。PD-L1是PD-1的配体，两者的表达会降低患者自身免疫力，尤其在肿瘤中的高表达可能会严重影响患者预后[6]。Papadaki等[7]在乳腺癌患者外周血中CTC上检测到PD-L1的表达，证实了CTC细胞膜上具有PD-L1蛋白的表达并且验证了CTC PD-L1检测的可行性。近年来，多项临床研究发现CTC PD-L1表达水平与疗效密切相关。Jacot等[8]在关于乳腺癌PD-L1液体活检与传统侵入式活检相关性的研究中发现PD-L1+CTC的表达可能比原发肿瘤细胞上PD-L1表达更好的反应预后，检测CTC PD-L1作为液体活检似乎是一种评估转移性乳腺癌的有效方法，它绕过了原发性肿瘤和各种转移位点之间的生物标志物的异质表达。侵入式活检出现并发症的风险高，只能从有限的肿瘤切片中取样，相比传统侵入式活检，CTC PD-L1检测具有无创、方便、实时、动态等优势，在恶性肿瘤患者治疗疗效评价及预后预测方面具有极大的临床应用价值。因此，研究CTC PD-L1的临床应用价值显得非常有意义。

1 CTC PD-L1表达检测原理

CTC的检测方法有多种，但目前主流的技术为第三代基于物理或生化特性的微流控芯片技术。CTC PD-L1富集检测原理是基于特异性抗体纳米微流控免疫捕获结合免疫荧光染色。检测分为两部分，包括CTC的筛选和对筛选出来的CTC进行免疫荧光染色，从而鉴别出PD-L1阳性的CTC。首先对患者外周血进行预处理，获得单核细胞层（PBMCs层），然后对纳米微流控芯片（即CytoNanoChip芯片）进行抗体包被，利用CytoSorter 循环肿瘤细胞分析仪，将洗涤后的PBMCs样本通过SCx螺旋样品室导入到包被有捕获抗体的纳米微流控芯片中，从而富集到CTC；然后再利用PDL1-CY5、PanCK-FITC、CSV-FITC和CD45-PE，以及Hoechst对富集到的CTC进行染色，在荧光显微镜下观察细胞免疫荧光染色结果，根据染色的情况，筛选出PD-L1+CTC。首先通过生物素标记上皮黏附蛋白（EpCAM）和细胞表面波形蛋白（cell surface vimentin,CSV）抗体结合微流控纳米芯片免疫捕获系统捕获上皮间质混合型CTC，然后利用荧光显微镜成像技术检测PD-L1-CY5、PanCK-FITC、CSV-FITC和CD45-PE，鉴定PD-L1阳性表达的CTC，见图1。

2 CTC PD-L1在临床中的应用

免疫组织化学方法检测肿瘤患者PD-L1表达是目前公认的最有效的方法，FDA已经批准了四种基于免疫组织化学（IHC）的分析，作为风险/效益评估的伴随诊断。然而，对于PD-L1 IHC的预测价值仍存在争议，因为一些PD-L1阴性肿瘤患者也可从抗免疫治疗中获益，如转移性黑色素瘤、鳞状NSCLC和RCC等，或者在治疗反应和PD-L1状态之间没有显著的相关性。PD-L1表达界值的变异性大，以及测试PD-L1表达的细胞类型，为PD-L1 IHC在临床实践中的使用提出了重大挑战[13-16]。此外，原发性和转移性肿瘤之间的异质性表达及不同时间点的动态变化进一步限制了PD-L1 IHC的可行性，因为在某一个部位的活检不能代表整个肿瘤或转移性特征。作为转移驱动的前体，CTC可能具有原发性肿瘤细胞或转移细胞的特征[17]，因此CTC PD-L1可以更好地代表整个肿瘤的发展状态、提供更全面的信息。另外，CTC PD-L1检测不同于肿瘤活组织检查，血液样本可以通过较少侵入性和频繁获得便于纵向监测。CTC PD-L1检测将会成为未来组织PD-L1检测的有效替代方法。通过对CTC PD-L1表达含量的检测可以为肿瘤的诊断提供可能依据，为肿瘤患者预后提供参考价值和监测，以便能在肿瘤发生转移前及时地干预治疗，还可以为肿瘤患者的化疗及免疫治疗提供指导，给患者带来巨大受益。

2.1 早诊早筛

CTC的临床应用价值已经有了大量的研究，美国FDA也早已批准将CTC检测应用于乳腺癌的诊断[18]。近年来，研究发现CTC在肝癌诊断方面作为新生标志物具有重要意义[19]。因此，CTC检测可以对肿瘤进行早诊早筛。CTC PD-L1表达检测目前尚无明确应用于早期诊断的报告，其主要应用于转移性肿瘤的疾病监测和预后上。因此循环肿瘤细胞PD-L1表达在早诊早筛方面的应用价值有限。

2.2 疗效评估及指导治疗

PD-L1是用于PD-1/PD-L1检查点阻断治疗的最佳研究和合理的免疫生物标志物。Yue等[20]在一项关于PD-1阻断治疗晚期实体瘤患者CTC PD-L1表达的动态变化研究中发现PD-L1+CTC可作为筛选PD-1/PD-L1阻断治疗患者的预测指标，测定CTC PD-L1动态变化可早期提示治疗反应。Yue等使用PD-1抑制剂IBI308治疗晚期胃肠道肿瘤的Ⅰ期试验中纳入35例患者，并且分析了CTC PD-L1表达水平，发现PD-L1high+CTC的疾病控制率（disease control rate,DC）更高，基线时PD-L1high+CTC的丰度对无进展生存期（progression free survival,PFS）有预测意义。Tomita等[21]在一项关于小细胞肺癌的临床试验研究中发现RRx-001（一种新型表观遗传调节剂，具有抗肿瘤的活性）治疗后CTC PD-L1表达量减少与临床疗效呈正相关，在RRx-001治疗小细胞肺癌过程中监测CTC PD-L1的表达可达到预测RRx-001癌症治疗反应的目的。Nicolazzo等[22]使用PD-1抑制剂尼伏鲁单抗治疗24例非小细胞肺癌患者后所有PD-L1-CTC的患者都获得了临床效益，而PD-L1+CTC的患者都发生了疾病进展，PD-L1+CTC持续性表达反映了一种治疗逃逸机制，因此在疾病发生过程中实时检测患者CTC PD-L1表达状况可以知悉肿瘤逃逸机制和对免疫治疗进行疗效评估。大量研究表明动态监测CTC PD-L1表达可以对免疫治疗疗效进行评估，但同时部分研究中可评估的患者数量有限，缺乏多中心随机对照试验支撑。因此CTC PD-L1的表达作为肿瘤患者疗效评估指标还需要进行多中心、大样本临床试验研究。

此外，PD-L1+CTC的表达水平也可作为指导肿瘤患者治疗的生物标志物。Raimondi等[23]在分析40例转移性结直肠癌患者接受瑞戈非尼治疗的疗效分析试验中，发现PD-L1+CTC患者接受瑞戈非尼后PFS、OS明显较长。因此，CTC PD-L1可以预测瑞戈非尼治疗转移性结直肠癌患者的受益人群，从而提供高度个性化的治疗方案。由于并非所有肿瘤患者都能从化疗、靶向药物及免疫治疗中获益，所以根据患者CTC PD-L1的表达选择合适的治疗药物，可进一步提高患者生存率。

2.3 预后判断

近年来研究表明CTC PD-L1的表达可以预测膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、胃癌等的预后。因此，CTC PD-L1的表达可能成为判断肿瘤患者预后的新一代重要的“液体活检”标志物。Anantharaman等[24]探讨CTC PD-L1表达对浸润性膀胱癌患者临床预后价值的临床试验中，发现PD-L1high+CTC的患者较PD-L1low+CTC的患者的总体生存率低。Strati等[25]在分析PD-L1+CTC是否可用于预测头颈部鳞状细胞癌患者的治疗疗效的研究中，发现治疗结束时PD-L1+CTC过表达的患者PFS和总生存期（overall survival,OS）均较短，并且是PFS和OS的独立预后因素。Cheng等[26]在对41例初治非小细胞肺癌患者CTC PD-L1检测中，发现PD-L1+CTC的初始治疗患者的PFS短于PD-L1-CTC的患者。Dall′Olio等[27]在免疫抑制剂治疗39例晚期非小细胞癌患者的研究中发现，PD-L1+CTC较PDL1-CTC患者OS更长且CTC PD-L1的表达与组织PD-L1的表达无相关性。Bergmann等[28]分析49例晚期尿路上皮癌患者外周血CTC PD-L1的表达状况的研究中，发现患者自身和患者间存在CTC PD-L1的异质性表达，并且PD-L1+CTC与较差的OS相关。Jacot等[8]评价了72例转移性乳腺癌患者CTC PD-L1与组织内PD-L1表达的临床病理相关性和预后价值，发现PD-L1+CTC表达与无进展生存期显著相关，而组织PD-L1阳性表达与无进展生存期无关。Tomita等[21]对14例小细胞肺癌患者进行RRx-001治疗前后CTC PD-L1表达与临床预后的Logistic回归模型ROC分析研究中表明，治疗后PD-L1+CTC的表达降低与较好的临床结局相关。Winograd等[29]在对87例肝细胞癌患者CTC PD-L1表达对预后影响的研究中发现PD-L1+CTC较PD-L1-CTC患者OS明显较短，CTC PD-L1是独立预后因子。Liu等[30]在对70例胃癌患者外周血CTC PD-L1表达的研究中，发现PD-L1+CTC与OS短、疗效差显著相关，可以作为胃癌的临床预后标志物。因此，外周血CTC PD-L1的表达水平对临床预后具有一定的预测价值。综上所述，由于组织检测PD-L1表达存在局限性，因此PD-L1+CTC可以作为转移风险高、预后不良的肿瘤患者的潜在生物标志物；能够帮助筛选出免疫治疗的获益人群，可以更精准地评估肿瘤患者的预后及疾病变化趋势。

2.4 免疫治疗监测

目前CTC检测已经被FDA批准用于转移性乳腺癌和结直肠癌患者的疾病监测和预测[31],CTC PD-L1的表达有可能作为监测肿瘤患者免疫治疗过程的有效标志物。Zhang等[32]在研究30例前列腺癌CTC免疫检查点的表达情况中发现CTC PD-L1在疾病状态间存在异质性表达，并且可以对前列腺癌患者的免疫治疗进行监测。Dhar等[33]在评价22例转移性肺癌CTC PD-L1表达的研究中，发现对患者总体CTC计数和PD-L1+CTC计数的连续监测可能有助于识别治疗后的变化。因此，CTC PD-L1的表达可能是精准医学的一个辅助的生物标志物，有助于确定免疫治疗的反应。CTC PD-L1检测在CTC的基础上必将更好的监测治疗过程中疾病变化、预测结局。

3 循环肿瘤细胞PD-L1临床应用的局限性

CTC PD-L1表达的临床研究在部分实体肿瘤中已经取得了一些进展，但这些研究对于其应用于临床还远远不够。CTC PD-L1表达在临床应用中还将面临很多挑战，最主要的是在各种实体瘤中表达程度不一，这可能与检测技术标准不同有关。其次，临床上接受免疫治疗的绝大部分患者已经进入晚期，在接受了放、化疗疗效不佳的情况下才选用免疫治疗[34]，因此患者的既往治疗方案对于CTC PD-L1表达的检测结果有一定影响。另外，该项检查的费用昂贵及缺乏循证医学的支持也是造成其临床应用受限的因素之一[35]。

4 总结与展望

CTC PD-L1作为一种无创、简便的“液体活检”技术在肿瘤的疗效评估、指导化疗、免疫治疗监测、肿瘤复发转移监测方面有着广阔的应用前景，尤其在肿瘤患者预后评估方面有着重要价值。目前PD-L1+CTC表达程度暂无定量标准，如何根据CTC PD-L1表达状况定性定量地评估疗效、指导化疗、监测免疫治疗及肿瘤复发转移，将成为我们要解决的主要问题。CTC PD-L1检测技术的迅速发展能够更好地帮助我们进一步理解肿瘤的免疫治疗及肿瘤复发转移的影响因素。虽然CTC PD-L1检测在临床上已经初步应用，但目前尚处于初级阶段，缺乏大规模、多中心的临床试验研究。近年来针对循环肿瘤核酸（circulating tumor DNA,ctDNA）[36]、细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）[37]及循环肿瘤细胞[3]等标志物的检测、分析是“液体活检”应用于临床实践的关键环节。虽然循环肿瘤核酸、细胞外囊泡等也可以反映肿瘤的侵袭与转移、监测肿瘤的疗效和评估预后，但是仍缺乏公认有效的检测手段，循环肿瘤细胞较CTC PD-L1缺乏特异性。由于在肿瘤患者中，CTC PD-L1单一检测的预测作用有限，因此联合临床其他“液体活检”的指标能更加准确、全面地对肿瘤进行综合预测评估。