Se-Ca联合膳食干预缓解Cd诱导小鼠肝肾毒性

吴杨洋,彭祥雯,史可欣,匡雯洁,孙 宏,黄 蕾*

Se-Ca联合膳食干预缓解Cd诱导小鼠肝肾毒性

吴杨洋1,彭祥雯1,史可欣1,匡雯洁1,孙 宏2,黄 蕾1*

(1.南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室, 江苏 南京 210023；2.江苏省疾病预防控制中心,江苏 南京 210023)

为探究Se-Ca联合膳食干预对生物Cd中毒的缓解效果,选取88只BALB/c 小鼠,随机划分为19组,在相同饲料Cd暴露浓度下(2mg/kg)分别设置低、中、高浓度的Se和Ca单独和联合膳食干预处理,并观察30d后小鼠的生长发育、肝肾功能、氧化应激状态和组织病理变化.结果显示,Se-Ca联合干预可有效缓解Cd蓄积所致小鼠生长发育迟缓现象,且进一步促进小鼠生长;肝肾功能及氧化应激指标测定结果表明,Se-Ca联合干预对Cd暴露下小鼠肝脏AST、GSH、SOD、GSH-Px和肾脏BUN、MDA、SOD的保护效果优于单一元素干预;联合干预仅需较小剂量即可达到单独Se或Ca干预对肝肾病理损伤的最佳缓解效果.Se-Ca联合膳食干预可有效缓解Cd摄入导致的生长发育缓慢和肝肾毒性,且较之单一元素的干预效果更佳.

镉；膳食硒钙补充；膳食干预；肝肾损伤

镉(Cd)是当下我国农业土壤的主要重金属污染物[1-2],它可通过膳食摄入蓄积于人体肝脏、肾脏,导致肝毒性、肾毒性[3].环境中存在的低剂量Cd同样会引发人和动物组织氧化损伤、诱发细胞凋亡,威胁脏器健康[4-6],并与人体心脑血管疾病[7]、肿瘤[8]等恶性疾病密切相关.

已有研究通过添加矿物质营养元素缓解Cd致生物毒性[9-10].在Cd暴露条件下,小鼠分别摄入Se(0.1mg/kg体重)、Ca(2540～4710mg/kg体重)可显著缓解Cd诱导的氧化应激反应及肝肾损伤[10],减少胃肠道中约50%的Cd吸收[9].硒(Se)作为人体必须微量元素和常量元素钙(Ca)在生物体内与Cd产生拮抗作用,抑制氧化应激、降低Cd吸收效率,可有效减轻Cd对生物体的健康损害.

但此前研究仅关注Se/Ca单独干预的缓解效果,鲜有关注二者联合干预降低Cd蓄积所致肝肾毒性的相关研究.本文通过小鼠动物实验分别检测多浓度梯度Se-Ca联合膳食干预与单独Se/Ca干预对相同Cd暴露环境下小鼠生长发育、肝肾功能和氧化应激的干预效果并进行组织病理学观察,旨在评估Se-Ca联合饮食干预的有效性及最佳干预方案,为多元素膳食干预缓解Cd的生理毒性研究提供新思路.

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6周龄健康Balb/C小鼠购自青龙山实验动物养殖场(中国南京).在标准动物房条件下(12:12h光照/黑暗循环,25℃和50%湿度)适应性饲养一周,随后进行实验.

1.2 实验分组与处理方案

表1 实验分组及处理方案

注: ♂代表雄性小鼠,♀代表雄性小鼠.

将88只雌雄各半小鼠随机分为19组,平均体重 [SD] (17.2 ± 2.0)g.综合考虑预实验结果及《食品安全国家标准食品中污染物限量》[11][GB2762-2017],确定小鼠摄入Cd水平为2mg/kg饲料.预实验结果表明,该剂量会导致小鼠30d内产生肝脏及肾脏毒性.考虑小鼠饲料的适口性及相关标准[12],Se、Ca分别设置低、中、高浓度梯度的膳食干预:Se(0.1,1, 10mg/kg饲料),Ca(2,20,100g/kg饲料).共计设置Ca单独干预 (3组)、Se单独干预(3组)和Se-Ca联合干预(9组) 3种干预方案,以探究Ca、Se单独及联合干预最佳剂量组合,具体实验分组及处理方案如表1所示.Cd、Ca和Se分别以CdCl2(分析纯)、CaCO3(分析纯)和硒代蛋氨酸(C5H11NO2Se)的形式添加到特制的鼠饲料中.以上试剂分别购于南京晚晴化玻仪器有限公司和博美生物科技有限责任公司.

30d干预期内,早上9:00喂食小鼠约4g特制饲料并记录小鼠体重,实验过程中没有小鼠死亡.干预结束后,禁食12h,颈椎脱臼法处死小鼠.

1.3 样品制备

颈椎脱臼法处死小鼠,眼眶取血,血液常温静置2h,3500r/min离心30min,收集血清保存于-80℃恒温冰箱.迅速分离小鼠肝脏和肾脏,脏器左部固定于4%多聚甲醛(POM,南京森贝伽生物)溶液,制备常规病理组织石蜡切片用于组织病理学观察;脏器右部分按1:9重量(g)/体积(mL)加入生理盐水,并置于冰水浴中,漩涡混匀器混匀制得组织匀浆,2500r/min离心10min,取上清液,-20℃保存以检测脏器功能和氧化应激指标.

1.4 测定指标与方法

1.4.1 脏器功能指标检测 分别使用谷丙转氨酶试剂盒(C009-2-1)、谷草转氨酶试剂盒(C010-1-1)测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性以表征肝脏功能.分别使用尿素氮试剂盒(C013- 2-1)、肌酐试剂盒(C011-1-1)测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量.

1.4.2 氧化应激相关指标检测 分别使用MDA检测试剂盒(A003-1-2)、GSH检测试剂盒(A006-1-1)、SOD检测试剂盒(A001-3-2)、GSH-Px检测试剂盒(A005-1-1)和CAT检测试剂盒(A007-1-1)测定肝脏、肾脏丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性.以上试剂均购于南京建成生物有限公司.

1.4.3 组织病理学观察 肝脏、肾脏石蜡切片进行苏木素-伊红(HE)染色.在光学显微镜下(200×)观察组织病理学结构变化并拍照,根据观察结果,将小鼠脏器病变程度由轻到重分别记为0～4分(正常0分,轻微0.5分,轻度1分,中度2分,重度3分,非常严重4分).

1.5 统计学分析

实验数据以平均值±标准差(Mean ± SD)表示,依据表1组别编号,进行One-Way ANOVA、LSD事后检验并进行组间比较.数据统计分析基于SPSS 22.0软件,并利用Origin 2018软件作图.当<0.05时认为具有统计学上的显著性差异.

2 结果与分析

2.1 膳食干预对小鼠体重影响

由图1可见, Ca、Se单独及联合干预均促进小鼠体重增长,Cd暴露则起抑制作用.其中,Ca单独干预对小鼠生长发育的促进作用呈剂量依赖关系,高Ca促进小鼠体重增长幅度最大(<0.001, (5.96±1.31)g). Se单独干预、Se-Ca联合干预未见剂量依赖关系.中Se干预下小鼠体重增量呈极显著升高(<0.001),中Se低Ca组干预效果最佳(<0.001).对比单独Ca、单独Se和Se-Ca联合干预中各组最佳剂量的干预效果表明,高Ca组对小鼠体重干预效果最佳,但3组之间未呈现统计学差异(>0.05).

图1 各组小鼠体重变化比较

与对照组相比, *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001; 与Cd组相比,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001

2.2 小鼠肝肾功能检测

肝(ALT、AST)、肾(BUN、Cr)功能指标显示,Cd组暴露引起肝、肾功能障碍,小鼠血清ALT和AST活性,以及BUN和Cr含量均极显著高于对照组(<0.001).由图2可见,Se、Ca单独及联合干预均可有效降低小鼠血清ALT和AST活性、BUN和Cr含量 (BUN<0.05,其他<0.001),高Se高Ca膳食干预对抑制Cd诱导ALT、AST和BUN升高现象的缓解作用最好,高Se干预对Cd诱导Cr升高的缓解效果最佳.

图2 各组血清中ALT和AST活力及BUN和Cr含量结果

与对照组相比, *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001;与Cd组相比,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001

2.3 脏器氧化应激指标测定结果

图3 各组小鼠肝脏SOD(a)、GSH-Px(b)和CAT(c)活性及MDA(d)和GSH(e)含量

与对照组相比, *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001; 与Cd组相比,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001

图4 各组小鼠肾脏SOD(a)、GSH-Px(b)和CAT(c)的活性以及MDA(d)和GSH(e)的含量

与对照组相比, *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001; 与Cd组相比, #< 0.05,##< 0.01,###< 0.001

与对照组相比,Cd组小鼠肝脏及肾脏SOD、GSH-Px和CAT活性均显著降低(SOD<0.01,其他<0.001),GSH含量显著减少(<0.001),同时氧化应激产物MDA含量显著升高(<0.001)(图3,图4).肝肾氧化应激指标测定结果表明,Se、Ca单独及联合干预可有效缓解Cd诱发的氧化应激反应,使之趋向于正常水平.肝脏氧化应激指标表明,高Se高Ca联合干预对维持肝脏SOD、GSH-Px活性和GSH含量的保护作用最强,高Se干预对MDA的抑制效果最强,高Ca干预对Cd诱发的CAT活性降低现象缓解效果最好;对于肾脏,高Se高Ca组对提高SOD活性和抑制MDA含量的干预效果最强,高Se干预可增强肾脏GSH和CAT活性,高Ca干预对GSH-Px保护效果最佳.

2.4 脏器病理损伤评估

如图5所示, Cd组肝脏切片可见明显的肝窦淤血和炎细胞浸润症状,而经高Ca、高Se及中Se中Ca干预后的小鼠肝脏切片肝窦淤血明显减少,且无炎细胞浸润症状,表明Se、Ca单独及联合干预均可部分缓解Cd引起的肝脏炎症和病理损伤.如图6所示, Cd组小鼠肾脏切片可见明显的透明管型和炎细胞浸润症状.经高Ca、高Se和中Se高Ca联合干预后,小鼠肾脏切片透明管型和炎细胞浸润均减少,可见Se、Ca单独及联合干预同样均可部分缓解Cd引起的肾脏炎症和病理损伤.其中,高Ca组和高Se组肾脏切片炎细胞浸润症状完全消失.

图5 各组小鼠肝脏病理切片

光学显微镜观察(200´),黄色箭头表示炎细胞浸润,黑色箭头表示肝窦淤血

图6 各组小鼠肾脏病理切片

光学显微镜观察(200´),黄色箭头表示炎细胞浸润,黑色箭头表示透明管型

病理评估结果显示(图7),Cd组肝脏、肾脏病理评分均显著高于对照组(<0.001).中Se中Ca剂量干预显著降低小鼠肝脏病理评分(<0.01),对Cd诱导小鼠肝脏病理性损伤的缓解作用最好;中Se高Ca剂量干预显著降低小鼠肾脏病理评分(<0.001),对Cd暴露下小鼠肾脏组织结构的保护效果最佳.

图7 各组小鼠肝脏和肾脏病理得分

与对照组相比, *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001; 与Cd组相比,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001

3 讨论

Cd暴露显著抑制小鼠体重增长,而不同浓度梯度Ca、Se单独及联合干预均促进小鼠体重增长,故适量摄入Se、Ca有助于降低Cd对生物生长发育的不利影响.其中,单独干预效果与此前Su等[13]研究结果一致,食用富硒大米+Cd的小鼠60d后体重显著高于Cd组,且高于对照组.不同干预下小鼠体重并未呈现显著差异,Se-Ca联合干预在促进小鼠生长方面并未优于单一元素干预.血液中ALT、AST与血清中BUN和Cr水平分别是临床诊断中评价肝功能、肾小球滤过功能的重要指标,后者常用于急性肾损伤综合征诊断.Cd组中上述指标均极显著高于对照组,这与先前研究结果一致[14-15],表明Cd暴露导致肝、肾功能障碍.研究结果表明,经Se、Ca单独及联合膳食干预,Cd暴露所致小鼠肝肾功能障碍得到有效缓解,并发现在高Se干预基础上,添加适量Ca对小鼠肝肾功能的保护作用更强.结合此前研究,Ca和Se对肝肾功能的保护作用与它们对氧化应激状态的调节作用有关[10,16].Cd在生物体内破坏正常氧化还原平衡状态,增加活性氧(ROS),消耗细胞内GSH含量和抗氧化酶,增强脂质过氧化,致使脂质过氧化物MDA含量升高[10,17].本研究佐证上述结论,发现Cd组小鼠肝脏和肾脏SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶活性均显著降低,GSH含量显著减少,MDA含量显著升高,而Se/Ca单独和联合干预可使上述指标趋近于正常水平.Cd抑制抗氧化酶活性,削弱机体自由基清除能力,导致肝脏及肾脏氧化应激反应和脂质过氧化,而自由基和过氧化中间产物破坏肝肾细胞结构完整性和正常功能并进一步促使小鼠的肝肾功能受损[18-19].Se可通过激活抗氧化酶、减少脂质过氧化和再生谷胱甘肽保护肝脏和肾脏[17],Ca可通过与Cd竞争转运蛋白、抑制Cd吸收产生保护作用[20].本研究发现,相比于Se或Ca单独干预,高Se高Ca联合干预对Cd致肝脏SOD、GSH-Px和GSH与肾脏SOD和MDA变化的拮抗作用最强,推测Se-Ca联合干预缓解Cd致肝肾氧化应激反应及功能障碍的效果优于单一Se或Ca干预.

组织病理学检查表明,Cd暴露导致肝肾发生明显的病理变化,Se、Ca单独及联合干预均可部分缓解Cd致肝脏和肾脏病理损伤,但不能完全消除负面影响.病理评估结果显示,中Se中Ca、中Se高Ca剂量干预对Cd诱导小鼠肝脏和肾脏病理性损伤的缓解作用较单一元素的干预效果更佳, Se-Ca联合干预仅需较低剂量即可达到Se或Ca单独干预对肝肾组织损伤的最佳保护效果.

4 结论

4.1 Se、Ca单独干预对Cd暴露所致肝肾功能障碍、氧化应激反应和病理损伤的缓解作用呈剂量依赖关系.

4.2 高Se高Ca联合干预对Cd暴露所致小鼠肝肾功能障碍和氧化应激的缓解效果优于单一元素干预.

4.3 较低剂量联合膳食干预即可达到或超过高水平Se或Ca单独干预对Cd致肝肾组织病理损伤的最优保护效果.

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Alleviating cadmium toxicity to liver and kidney of mice with dietary supplementation of selenium and calcium in combination.

WU Yang-yang1, PENG Xiang-wen1, SHI Ke-xin1, KUANG Wen-jie1, SUN Hong2, HUANG Lei1*

(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China；2.Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210023, China)., 2022,42(3)：1379～1384

To explore the mitigation role of dietary selenium (Se) and calcium (Ca) supplementation in combination in alleviating the biological toxicity of Cd, an in vivo mouse bioassay was performed. Mice (BALB/c,= 88) that were exposed to Cd via diets at the same concentration of 2mg/kg were randomly divided to 19groups of dietary supplementation of low, medium, and high concentrations of Se and Ca in diets alone or in combination. The growth and development of mice, liver and kidney function, oxidative stress state and histopathological changes of the mice were measured after 30days of intervention. Results showed that the combined intervention of Se-Ca could effectively alleviate the growth retardation of mice caused by Cd exposure. In terms of liver and kidney function and oxidative stress, the combined intervention had a stronger protective effect on AST, GSH, SOD, GSH-Px in the liver and BUN, MDA and SOD in the kidney of mice than single Se or Ca intervention. Additionally, a lower dietary concentration of Se and Ca in combination alleviated pathological damage at a similar extent to that of a high concentration of Se or Ca alone. In general, Se-Ca dietary intervention in combination effectively alleviated the growth retardation and liver and kidney toxicity of mice caused by Cd exposure, and the effect was stronger than that of single element intervention.

cadmium；dietary selenium and calcium supplement；dietary intervention；liver and kidney damage

X174

A

1000-6923(2022)03-1379-06

吴杨洋(1998-),男,江苏盐城人,南京大学环境学院博士研究生,主要从事环境健康风险评估研究.发表论文4篇.

2021-08-06

国家重点研发计划项目(2019YFC1805105);江苏省自然科学基金资助项目(BK20201186);国家自然科学基金资助项目(41822709, 71921003)

*责任作者, 教授, huanglei@nju.edu.cn