卵黄囊瘤中肝细胞核因子1β的表达及诊断价值

王月娥，李 恒，王 伟，吴海波

卵黄囊瘤(又称内胚窦瘤)是一种少见的高度恶性原始生殖细胞肿瘤，主要发生于卵巢及睾丸等性腺器官，性腺外器官较罕见发生[1-2]。发生于婴幼儿的卵黄囊瘤多为单纯型，成人卵黄囊瘤多为混合型[3-4]。卵黄囊瘤组织学与原始卵黄囊间质形态相似，包括微囊/网状、乳头状、实性、黏液瘤样等。通常在同一肿瘤内可见多种形态[5]。因卵黄囊瘤形态多样，导致其作为混合型生殖细胞肿瘤的次要成分出现时，易误诊或漏诊。卵黄囊瘤高度恶性，转移发生早，易侵犯周围组织，因此正确识别卵黄囊瘤成分至关重要[6]。免疫组化染色有利于识别卵黄囊瘤的成分，但目前仍缺乏卵黄囊瘤的敏感性及特异性标志物。

肝细胞核因子1β(HNF1β)是卵巢透明细胞癌的常用标志物，亦可表达于子宫内膜异位症[7]，但其在卵黄囊瘤中的敏感性及特异性尚不清楚，目前仅有个别文献报道[8-9]。为明确HNF1β在卵黄囊瘤中的表达及意义，本文现对34例卵黄囊瘤及50例非卵黄囊瘤的生殖细胞肿瘤进行免疫组化分析，以明确HNF1β在卵黄囊瘤组织中的表达及其在鉴别诊断中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集2011年1月～2020年11月中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)诊治的39例卵黄囊瘤患者，其中5例因卵黄囊瘤成分较少而被舍弃，最终选用卵黄囊瘤组织充分的34例(包括2例穿刺标本及32例手术切除标本)进行分析。所有切片均经两位病理专家复核。同时随机选取50例非卵黄囊瘤的生殖细胞肿瘤进行对比分析。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，3 μm厚切片，行HE及免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision两步法，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。实验中所用抗体包括HNF1β(兔多抗，ZA-0129)、AFP(兔单抗，EP209)、GPC-3(鼠单抗，1G12)，均购自北京中杉金桥生物公司，且设有阳性、阴性对照。既往所有病例均已行相应标志物的免疫组化染色，如CD117(兔单抗，EP10)、CD30(兔单抗，EP154)等。

1.3 结果判读HNF1β表达定位于细胞核，呈棕黄色至棕褐色，颗粒状；AFP及GPC-3表达定位于细胞质。免疫组化评分标准参考文献[10]，染色评分由染色强度及阳性细胞百分比共同决定。(1)按染色强度计分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比计分：阳性细胞百分比<1%为1分，1%～10%为2分，11%～50%为3分，>50%为4分。最后将两项得分结果相乘：0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～6分为中等阳性，8～12分为强阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0软件对所有实验数据进行分析。敏感性及特异性的差异采用χ2检验或Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征34例卵黄囊瘤中单纯型卵黄囊瘤20例，混合型卵黄囊瘤14例。发病部位包括卵巢、睾丸等性腺器官及纵隔、松果体等性腺外器官。

20例单纯型卵黄囊瘤中，男性3例，女性17例，年龄范围1～68岁，平均年龄21.3岁，中位年龄20.5岁。不同发病部位的肿瘤组织形态学相似：包括明显的内胚窦样结构(Schiller-Duval小体)、微囊/网状、乳头状、实性、黏液瘤样结构等，间质常伴有大量出血、坏死。其中2例患者术前进行了化疗，包括1例发生于纵隔及1例复发的卵黄囊瘤患者。化疗后组织学形态与原发灶相似。

14例混合型卵黄囊瘤中，男性9例，女性5例，年龄范围5～45岁，平均年龄27.4岁，中位年龄31.5岁。混合型卵黄囊瘤中混合成分包括精原细胞瘤、无性细胞瘤、未成熟畸胎瘤等。其中1例发生于阴道残端为复发性病例，原发肿瘤为卵黄囊瘤混合无性细胞瘤。

其他生殖细胞肿瘤：本实验含随机选取的50例无卵黄囊瘤成分的生殖细胞肿瘤，包括15例成熟性畸胎瘤、11例未成熟畸胎瘤、10例精原细胞瘤、6例绒毛膜癌、5例无性细胞瘤、3例胚胎性癌。

2.2 免疫表型无论患者术前是否化疗，所有卵黄囊瘤中HNF1β均呈弥漫核阳性(2例弱阳性，8例中等阳性，24例强阳性)。在血管周样结构、乳头状、实性结构中阳性率较高，在黏液瘤样结构中阳性率稍低(图1～3)。化疗后其表达未见明显减弱(图4)。在混合型卵黄囊瘤中，卵黄囊瘤成分HNF1β阳性(图5、6)，其他成分均阴性。在成熟性畸胎瘤中伴有胃肠道黏膜及胰腺腺泡分化成分可见HNF1β胞核阳性，这些良性形态HE染色便可识别，一般不会误诊。部分绒毛膜癌细胞呈HNF1β胞质着色，因其非胞核着色，故判读为阴性。

图1 卵黄囊瘤中血管周结构HNF1β呈阳性，EnVision法 图2 卵黄囊瘤中实性结构HNF1β呈阳性，EnVision法 图3 卵黄囊瘤中黏液瘤样结构HNF1β呈阳性，EnVision法 图4 单纯型卵黄囊瘤，患者化疗3个疗程，HNF1β染色显示卵黄囊瘤成分阳性，EnVision法 图5 睾丸混合型生殖细胞肿瘤(精原细胞瘤+胚胎性癌+卵黄囊瘤):精原细胞瘤见大小相对一致的肿瘤细胞弥漫分布，混杂少量淋巴细胞；胚胎性癌由异型性较大的不规则腺腔构成；混杂少许不易观察到的卵黄囊瘤成分 图6 睾丸混合型生殖细胞肿瘤(精原细胞瘤+胚胎性癌+卵黄囊瘤)，HNF1β染色显示卵黄囊瘤成分为阳性，EnVision法

34例卵黄囊瘤中AFP阴性3例，弱阳性5例，中等阳性14例，强阳性12例。33.3%(1/3)胚胎性癌细胞AFP阳性，63.6%(7/11)未成熟畸胎瘤可见未成熟肠型腺体AFP阳性。AFP经常呈弥漫且强的非特异性着色(特别是在坏死或囊性区域)，此时应判读为阴性。

34例卵黄囊瘤中GPC-3阴性6例，弱阳性5例，中等阳性9例，强阳性14例。33.3%(2/6)绒毛膜癌细胞GPC-3阳性，45.5%(5/11)未成熟畸胎瘤中未成熟神经组织GPC-3阳性(表1)。

表1 生殖细胞肿瘤中HNF1β、AFP、GPC-3的表达

2.3 卵黄囊瘤中HNF1β、AFP及GPC-3表达的相关性分析34例卵黄囊瘤中HNF1β的敏感性高达100%，高于AFP(91.2%)及GPC-3(82.4%)，差异有统计学意义(P=0.025)。HNF1β的表达与患者性别(P=0.112)、年龄(P=0.274)均无关。HNF1β的特异性为98%，高于AFP(84.9%)及GPC-3(87.5%)，差异有统计学意义(P=0.031)。HNF1β比AFP具有更高的敏感性，比GPC-3具有更高的特异性。

3 讨论

WHO(2020)女性生殖系统肿瘤分类提出了卵黄囊瘤有11种生长方式，组织学形态的多样给诊断带来困难。在混合型生殖细胞肿瘤中卵黄囊瘤成分较少或与其他生殖细胞肿瘤的组织学形态有重叠时极易漏诊及误诊，不同成分的正确诊断对患者进一步的治疗及预后判断有重要意义。因此，区分卵黄囊瘤与其他肿瘤显得尤其重要。

AFP、GPC-3是临床诊断卵黄囊瘤常用的标志物[11]。AFP是白蛋白基因超家族成员，是一种由原始卵黄囊及次级卵黄囊产生的早期蛋白[12]，出生后几乎不再合成。但AFP在肝脏等病变中也能检测及[13]，免疫组化染色显示胞质着色，判读时易出现假阳性。有研究发现，在卵黄囊瘤的诊断中GPC-3是一种比AFP更特异的标志物[14]，但与AFP相似，GPC-3也可在其他非生殖细胞肿瘤中表达[15]。本组34例卵黄囊瘤中HNF1β仅在成熟性畸胎瘤部分分化成熟的成分(胃肠道和胰腺分化)中阳性，在未成熟成分中阴性。GPC-3可在未成熟神经外胚层(胚泡和神经管)中阳性，AFP也可在未成熟肠型腺体中阳性[16]，并且在未成熟畸胎瘤伴肝样分化患者的血清中检测到AFP表达水平升高[17]。因此，当出现未成熟畸胎瘤混合少许卵黄囊瘤成分时，易误诊或漏诊，而使用免疫组化标记HNF1β可以提高诊断的正确率。

肝细胞核因子(HNFs)是一组转录因子，在调节肝脏特异性基因转录中发挥重要作用[18]。这些转录因子并不局限于肝脏，亦可表达于其他组织。目前已知HNFs由4个不同的家族组成。HNF1α、HNF1β属于HNF1家族，具有共同的POU同源结构域，以同源二聚体的方式与DNA结合[18]，在原肠胚开始形成时，HNF1β最先在内胚层被检测及。

本实验发现，HNF1β在所有卵黄囊瘤成分中均阳性，敏感性为100%，表现为弥漫核阳性，同时HNF1β在分化成熟的肠型腺体及胰腺腺泡中呈核阳性。但不同组织学形态的卵黄囊瘤中HNF1β的表达略有不同，如在黏液瘤样型中阳性率最弱，在内胚窦样结构、乳头状及实性等结构中表达较强。化疗对HNF1β的表达影响较小，化疗前后的卵黄囊瘤成分HNF1β均呈弥漫核阳性。本组有1例原病理诊断不排除胚胎性癌或者卵黄囊瘤，因组织成分较少且AFP阴性，未做出明确诊断。但回顾性分析发现，卵黄囊瘤成分呈HNF1β弥漫核阳性，能较好的识别出不明显的卵黄囊瘤成分。HNF1β呈细胞核染色，相比AFP及GPC-3的胞质染色更易识别，且更容易对微小病灶进行检测。本实验中HNF1β的特异性高达98%，虽然成熟性畸胎瘤中分化成熟的消化道黏膜及胰腺中HNF1β阳性，但因其形态即可识别，因此不会误诊。本实验发现，HNF1β比AFP具有更高的敏感性，比GPC-3具有更高的特异性。相较于以往研究，本实验扩展了肿瘤的发病部位，而不局限于睾丸，并对比两种日常工作中使用的标志物AFP、GPC-3，结果发现HNF1β在多个系统的卵黄囊瘤中均有较好的敏感性及特异性。因此，在卵黄囊瘤的诊断工作中，联合使用HNF1β的免疫组化染色，可以提高诊断阳性率。

综上，本实验基于全身多个部位卵黄囊瘤的样本分析，发现HNF1β是卵黄囊瘤高度敏感及特异的标志物，在卵黄囊瘤的诊断及鉴别诊断中具有重要的意义，值得推广使用。