肿瘤坏死因子受体相关因子4在结直肠癌中的表达及临床意义

陈广业，杨 清

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，2018年全球新增180万例，死亡862 000例[1]。近年来结肠癌的发病率呈上升之势[1]。尽管根治性手术和辅助化疗可以提高结肠癌病人的生存率，但是肿瘤复发仍然是预后不良的主要原因[2]。寻找结肠癌潜在的分子生物学指标是临床和基础研究的重点。

肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是一类胞内接头蛋白，主要参与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体家族信号通路的调控，具有影响细胞增殖、存活、凋亡、参与免疫炎症反应等多种功能[3]。TRAF家族共7个成员，分别为TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7，其中TRAF4作用较为独特，它能同时作为TNF受体家族和Toll样/白细胞介素1受体家族的接头分子[3]。TRAF4在人体各种组织中均有表达，既往研究显示TRAF4可能作为促癌基因在乳腺癌[4]、宫颈癌[5]和非小细胞肺癌[6]等肿瘤中发挥作用。TRAF4可表达于结肠组织[7]，然而其在结肠癌中的表达及临床意义既往少有报道。本研究用免疫组织化学染色法检测结肠癌组织中TRAF4的表达，探讨其与结肠癌临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 样本来源 选取2009年1月至2010年10月在我院进行手术切除的112例结肠癌组织标本及其配对的癌旁组织标本(距离肿瘤边缘至少5 cm的正常肠黏膜组织)。组织石蜡标本均由我院病理科完成，厚度为4 μm。纳入标准：(1)组织病理学检查证实为结肠癌；(2)年龄≥18岁；(3)病例资料完整。排除标准：(1)严重的心肝肾功能异常；(2)合并其他部位肿瘤；(3)家族性腺瘤性息肉病或Lynch综合征。112例中男45例，女67例；年龄44～81岁。所有病人随访截至2019年1月。

1.2 免疫组织化学染色法检测组织中TRAF4的表达 本研究所用SP免疫组化试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司，实验时严格按照试剂盒说明书进行操作。将结肠癌组织和癌旁组织石蜡切片在70 ℃下烤片30 min，随后进行脱蜡处理。用Tris/EDTA修复液进行抗原修复，随后用羊血清封闭30 min。加入TRAF4兔抗人多克隆抗体(1∶1 000稀释，美国Santa Cruz公司)，4 ℃过夜，加入生物素标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500稀释，艾美捷科技有限公司)，37 ℃孵育30 min。用辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液和DAB显色液进行处理，苏木紫复染。经过脱水、透明、封片后在IX71型显微镜(日本OLYMPUS公司)下观察。

由我院两位病理科医师进行独立阅片，两人结果一致则记录结果，如有争议则请第三位医师看片，以两个相同结果为准。每张切片随机选择10个视野，每个视野计数100个细胞。染色为阴性计0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞数为0%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，81%～100%计4分。将上述两个评分相乘，对TRAF4表达情况进行评价：0分(阴性)，1～3分(弱阳性)，4～8分(中等阳性)，9～12分(强阳性)。0～3分为低表达，4～12分为高表达[8]。

1.3 统计学方法 采用χ2检验、Kaplan-Meier法、Log-rank检验和COX回归分析。

2 结果

2.1 TRAF4在结肠癌组织中的表达 TRAF4主要表达于细胞核中(见图1)。结肠癌组织中TRAF4高表达率为73.21%(82/112)，明显高于癌旁组织的33.04%(37/112)，差异有统计学意义(χ2=38.81，P<0.01)。

2.2 TRAF4表达与结肠癌临床病理特征的关系 低分化结肠癌病人的TRAF4高表达率明显高于高分化病人(P<0.01)，T分期越高，TRAF4高表达率越大(P<0.01)，M1期结肠癌病人的TRAF4高表达率明显高于M0期病人(P<0.01)。不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、肉眼分型、组织学类型、N分期的TRAF4表达差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 TRAF4表达与结肠癌临床病理特征的关系[n;百分率(%)]

续表1

2.3 结肠癌病人预后的影响因素分析 多因素分析结果显示，分化程度、T分期、N分期、M分期和TRAF4是结肠癌病人总体生存时间的独立影响因素(P<0.05)，分化程度、N分期、M分期和TRAF4是结肠癌病人无进展生存时间的独立影响因素(P<0.05)(见表2、3)。

表2 结肠癌病人总生存时间的影响多因素分析

表3 结肠癌病人无进展生存时间的单因素和多因素分析

2.4 TRAF4与结肠癌病人生存预后的关系 高表达组总体生存率和无进展生存率分别为64.29%和69.64%，均低于低表达组的82.43%和90.18%(χ2=3.15、4.92，P<0.05)。高表达组中位生存时间和无进展生存时间分别为70.92个月和72.55个月，均低于低表达组的84.81个月和89.66个月(uc=3.71、5.00,P<0.05)。

3 讨论

结肠癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，其发生、发展、浸润和转移的机制较为复杂。TRAF4是一种环状结构的E3链接酶，最早是通过乳腺癌淋巴结转移的cDNA文库筛选出来的有差异表达的基因[9]。越来越多研究显示，TRAF4可作为促癌基因在肿瘤性疾病中发挥作用，例如乳腺癌[4]、宫颈癌[5]、非小细胞肺癌[6]、子宫内膜癌[10]、肝细胞癌[11]和食管鳞癌[12]。既往研究[13-14]发现，结肠癌细胞系中TRAF4高表达，并且可以促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移。TRAF4在结肠癌组织中的表达及临床意义既往少有报道。本研究采用免疫组织化学染色法检测了112例结肠癌组织及其配对的癌旁组织中TRAF4的表达，结果显示结肠癌组织中TRAF4高表达率明显高于癌旁组织。

TRAF4作为促癌基因在肿瘤中的作用机制尚未完全明确。SINGH等[15]发现，TRAF4可以介导神经生长因子受体TkkA的泛素化，进而促进调节前列腺癌的转移。TRAF4可调控多条信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化，例如PI3K/AKT/Oct4信号通路[16]、PRMT5信号通路[17]和Wnt/β-catenin信号通路[18]等。另外TRAF4还可作为miRNA的下游靶基因而发挥作用[5,19]。

本研究发现，TRAF4与结肠癌的分化程度、T分期和M分期有关。提示TRAF4在结肠癌进展中发挥重要作用。本研究未发现TRAF4与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、肉眼分型、组织学类型和N分期有关。影响结肠癌病人预后的因素有很多，本研究发现分化程度、T分期、N分期、M分期是影响结肠癌病人生存预后的独立影响因素，这与既往报道一致[8,20-21]。COX多因素分析证实TRAF4与结肠癌病人不良预后有关，TRAF4高表达组的总生存时间和无进展生存时间均低于低表达组，提示TRAF4可能会成为结肠癌预后的评价指标。

综上所述，结肠癌组织中TRAF4高表达率明显高于癌旁组织，TRAF4与结肠癌分化程度、T分期、M分期有关。TRAF4高表达预示着结肠癌病人的不良生存预后，有可能成为结肠癌的分子生物学指标。本研究存在一些局限性，例如未检测病人血清中TRAF4的表达水平，其对结肠癌诊断和鉴别诊断的价值需要未来进一步分析；未深入分析TRAF4在结肠癌中的作用机制。