槐耳制剂辅助治疗肝细胞癌的作用机制及其临床应用进展

谢铠岭，徐 锋

中国医科大学附属盛京医院 普通外科，沈阳 110004

原发性肝癌是我国第二大疾病相关死亡原因，其中80%以上为肝细胞癌(HCC)，严重威胁着居民的生命和健康[1]。HCC起病隐匿，早期缺乏症状，绝大部分患者确诊时已是中晚期，失去了手术治疗机会。尽管医疗技术水平不断提高，新的靶向药物和免疫检查点抑制剂等不断涌现，但现阶段我国HCC患者总体疗效尚不理想，5年总体生存率不足15%[2]。因此，HCC综合治疗任重道远。

中医具有扶正固本、活血消癥的作用。槐耳是多孔菌科真菌槐栓菌的子实体。槐耳清膏是槐耳菌质发酵后的热提取物，由10余种矿物质和多种有机成分构成，主要活性成分为蛋白多糖。槐耳颗粒即槐耳清膏颗粒剂型，已被应用于HCC的综合治疗[3-5]中，具有改善肝区疼痛、腹胀、乏力等症状的作用，可显著提高HCC的治疗效果。随着研究不断深入，发现其作用机理愈加复杂，内容涉及抑制细胞增殖[6-12]、诱导细胞凋亡[6-8]和自噬[13-14]、抑制细胞转移与侵袭[15-18]、抑制血管内皮细胞增殖以阻断新血管生成[18-19]、免疫调节作用[20-27]、增强化疗敏感性[28-30]、改善肝损伤[31-32]以及调控与HCC发生发展进程相关的靶点和信号通路[10-12]等，但确切机制尚未完全阐明。故本文对槐耳在HCC中的研究进展进行总结，以期为其机制的深入研究和临床应用提供参考。

1 槐耳抗HCC作用机制

1.1 调控HCC生物行为以及抑制周围血管形成

1.1.1 抑制HCC细胞增殖 HCC是一种细胞周期性疾病，其发生发展与细胞增殖失控密切相关。过往的研究[6-10]证明槐耳可诱导HCC细胞周期阻滞以抑制其增殖。槐耳清膏可通过抑制MAPK信号通路下调细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CylinD、β-catenin等细胞周期调控蛋白以诱导HCC细胞G1/S期阻滞[6-8]。槐耳清膏可下调微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance protein,MMC)的表达，阻滞HCC细胞于G1/S期[9]。槐耳清膏还可上调CDK抑制剂P18的表达以诱导细胞周期G0/G1阻滞[10]。此外，还有研究[11]表明槐耳可上调HBx基因和下调CEACAM1基因表达以抑制HCC细胞增殖；槐耳清膏可下调核纤层蛋白(LaminB1)的表达并增强肾母细胞过表达基因(nephroblastoma overexpressed，NOV)水平，从而抑制HCC细胞的增殖和侵袭能力[10]；槐耳还可促进Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)细胞核移位至细胞质，从而促进YAP1的磷酸化和泛素化降解等过程以抑制HCC细胞的增殖、迁移[12]。

1.1.2 激活凋亡和自噬 细胞凋亡是癌症发生发展进程中的一道天然屏障，通过药物诱导细胞凋亡治疗癌症具有重要意义。过往的研究发现槐耳能激活Caspse级联以诱导HCC细胞凋亡。Bao等[8]发现，槐耳多糖可激活p38 MAPK 信号通路，上调促癌蛋白Bax和生存素的表达、下调抑癌蛋白Bcl-2的表达，从而诱导HCC细胞凋亡。Zhang等[6]研究显示，槐耳清膏能激活Caspse3、上调Cleaved-Caspse3和Cleaved-PARP的表达以诱导HCC细胞凋亡。槐耳清膏还能通过抑制MEK-ERK信号通路诱导HCC细胞凋亡[7]。

自噬是一种将细胞材料输送到溶酶体进行降解的细胞死亡机制，当前认为自噬起到促进肿瘤细胞存活和抑制肿瘤细胞生长双重作用[33]。杨爱琳等[13]研究发现，槐耳清膏可激活细胞自噬以抑制HCC细胞增殖。黎文信等[14]研究发现槐耳清膏可能通过抑制 Akt/mTOR 信号通路诱导自噬，发挥抗肿瘤效应。

1.1.3 抑制上皮间质转化(EMT)以阻碍HCC细胞的侵袭和转移 EMT是癌症发展过程中的关键环节，细胞通过EMT失去部分上皮细胞特性，获得部分间质细胞特性，从而获得侵袭和迁移的能力[34]。Zheng等[15-16]研究证实，槐耳多糖可抑制PI3k/Akt信号通路，下调星型胶质细胞1(AEG-1)shRNA的表达，从而阻断HCC细胞的EMT。Li等[17-18]研究发现，槐耳多糖可通过抑制AUF-1/AEG-1信号通路、上调上皮标志物E-cadherin表达、下调间质标志物N-cadherin表达以阻断HCC细胞的EMT，抑制裸鼠异种移植模型中HCC细胞向肺转移。由此可见，槐耳可通过抑制EMT，从而阻碍HCC细胞的侵袭和转移。

1.1.4 抑制周围血管生成 HCC是高度血管化的肿瘤，HCC细胞在生长过程中能分泌多种细胞因子诱导血管内皮细胞增殖以促进新生血管形成，加速HCC细胞的转移进程；同时由于新血管的生成使得肿瘤细胞获得更多的营养，加快了HCC细胞的增殖速度。因此，抑制新血管生成是HCC治疗的有效策略之一。Zou等[19]研究发现，槐耳多糖可下调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)1α的表达，以及降低微血管密度(microvessel density,MVD)；其还可通过下调HIFα/VEGF和AUF-1/AEG-1信号通路，降低MVD，从而抑制新血管生成[18]。由此可见，槐耳能够通过抑制血管生成发挥抗肿瘤作用。

1.2 调控免疫应答

1.2.1 固有免疫应答的调节 巨噬细胞是固有免疫应答的重要组成部分。在肿瘤微环境中，巨噬细胞存在两种极化状态：经典激活的巨噬细胞(M1型)和替代激活的巨噬细胞(M2型)。在肿瘤微环境中，M1型巨噬细胞主要发挥抗肿瘤作用，M2型巨噬细胞主要发挥促进肿瘤生长作用[35]。有研究[20]显示，槐耳清膏可抑制小鼠巨噬细胞M2极化和促进巨噬细胞M1活化。槐耳多糖还可显著上调一氧化氮合酶mRNA的表达，进而刺激巨噬细胞分泌NO以发挥抗肿瘤作用[21]。Yang等[22]研究发现，槐耳多糖可通过TLR4-NF-κB/MAPA信号通路刺激M1型巨噬细胞上调TNFα、IL-6和COX-2的表达，释放这些免疫因子。综上所述，槐耳可促进巨噬细胞M1活化、抑制巨噬细胞向M2极化，以增强巨噬细胞的抗肿瘤作用。

1.2.2 适应性免疫应答调节 当前认为CD4+和CD8+T淋巴细胞是T淋巴细胞亚群中的重要组成部分，在肿瘤免疫应答中，CD8+T淋巴细胞是最主要的效应细胞，CD4+T淋巴细胞能促进免疫细胞的增殖、分化以及免疫细胞间的相互作用[23]。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过多种途径使机体处于免疫紊乱状态，主要表现为CD4+T淋巴细胞减少、CD8+T淋巴细胞升高，CD4+T/CD8+T比值下降。Li等[24]发现，H22荷瘤小鼠经槐耳多糖干预后，外周血中CD4+T淋巴细胞百分比显著升高、CD8+T淋巴细胞数量显著减低。周林等[25]通过小鼠肝癌肝移植复发模型发现槐耳能提高小鼠外周血中CD4+T与CD8+T淋巴细胞的百分比。上述研究说明槐耳可在一定程度上纠正由肿瘤细胞引起的免疫紊乱。

调节性T淋巴细胞(Treg)在肿瘤免疫应答和移植免疫耐受中扮演着重要角色。研究[26]表明，即使Treg能诱导免疫耐受，但HCC患者术前的高Treg水平往往与生存时间和复发率呈显著负相关。这可能与Treg通过与CD4+T和CD8+T淋巴细胞直接或间接的相互作用影响肿瘤免疫有关。例如Treg可通过抑制CD8+T淋巴细胞释放穿孔素和颗粒酶帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸[27]。因此，降低患者术前的Treg水平，对于增强免疫和抗肿瘤作用，改善患者预后具有重要意义。Zhou等[36]在临床试验中发现，槐耳颗粒、西罗莫司和胸腺肽联合方案可显著降低肝移植患者的Treg和AFP水平，增加CD8+T淋巴细胞数量，降低术后复发率。Zhou等[27]还通过小鼠HCC肝移植复发模型，发现槐耳颗粒、西罗莫司和胸腺肽联合方案通过AKT-mTOR信号通路下调Treg 的表达、减少抑制性细胞因子的分泌，提高CD8+T淋巴细胞的数量与活性，从而发挥抗肿瘤作用。上述研究表明，槐耳具有改善负性免疫调节和改善肿瘤预后的作用。

1.3 逆转耐药性和改善肝功能 药物治疗(化疗、靶向和免疫治疗)是治疗癌症患者的重要手段之一。但随着患者使用时间的推移，会对药物产生耐药性，使得药物的治疗效果停滞不前。槐耳在一定程度上能逆转HCC的耐药性[28-30]。槐耳清膏可通过下调多药耐药基因1(multiple drug resistence 1,MDR1)表达和抑制细胞膜表面P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)功能，逆转HCC细胞对阿霉素的多重耐药性[28]。槐耳联合奥沙利铂可在一定程度上增强HCC细胞对奥沙利铂的化疗敏感性，其机制可能与下调YAP表达有关[29]。槐耳颗粒还能下调HIF1α/VEGF信号通路，逆转HCC细胞对索拉非尼的耐药性[30]。

临床上，HCC患者往往伴有不同程度的肝功能异常，提示肝癌细胞对肝脏造成了损伤。Xu等[31]通过小鼠诱癌模型发现槐耳能显著降低肝癌小鼠血清转氨酶水平，探究其机制发现与槐耳下调P53基因有关，这表明槐耳可能具有改善肝损伤的作用。另外有研究[32]显示槐耳颗粒可缓解奥沙利铂对肝脏造成的损伤，其机制与槐耳可上调PI3K/AKT/Nrf2通路有关。

2 槐耳颗粒的临床应用现状

现代医学主要应用手术、介入、放化疗等手段治疗HCC，但是疗效往往不太理想。近年来，关于槐耳颗粒联合西医疗法的临床研究较多，并取得了相应的进展。

2.1 手术联合槐耳颗粒 肝切除术仍是目前最普遍的治疗HCC的手段，但肝切除术后5年复发率接近70%。Chen等[37]进行的一项多中心、大样本、前瞻性随机对照试验(RCT)证明槐耳颗粒辅助治疗能有效降低HCC根治性切除术后的复发和肝外转移，槐耳颗粒组的2年无复发生存率(62.39% vs 49.05%，P<0.001)和总生存率(95.19% vs 91.46%，P=0.020 7)显著高于未使用槐耳颗粒组，槐耳颗粒可降低肝外复发率(8.60% vs 13.61%，P=0.001 8)。基于此研究，槐耳颗粒被推荐用于肝切除术后辅助治疗[38]。但上述研究存在一定的局限性，患者随访时间只有2年，而研究者以患者2年复发率来推测5年总生存率状况，因此需要进一步更长时间的高质量RCT来验证。

热消融近年来成为早期HCC的首选治疗方案，Wang等[3]进行的一项队列研究显示槐耳颗粒联合治疗能提高早期HCC患者的生存率，降低复发率和肝外转移率。

肝移植是目前治疗HCC最彻底，最有效的治疗方案。虽然免疫抑制剂降低了患者免疫排斥反应的发生率，但是增加了患者复发和转移风险。Lei等[39]研究显示，槐耳组肝移植术后无瘤生存率显著高于对照组(未服用槐耳颗粒)(P=0.029)，并且槐耳组10个月和30个月的肿瘤预测复发率显著低于对照组(P<0.05)。Zhou等[36]研究显示西罗莫司、胸腺肽联合槐耳颗粒治疗组肝移植患者1、3、5年的术后总生存率和无进展生存率显著高于西罗莫司联合胸腺肽治疗组(P值均<0.001)。研究表明，槐耳颗粒既能改善患者术后的免疫功能、降低肿瘤复发转移概率，同时亦不会增加免疫排斥反应的发生率。

2.2 经肝动脉化疗栓塞术(TACE)联合槐耳颗粒 对于不能接受外科手术的晚期HCC患者，TACE已经成为首选治疗方案。但单纯的TACE往往很难彻底消灭肿瘤，而槐耳颗粒的抗肿瘤作用可起到协同增强的效果[40]。一项Meta 分析[41]表明，TACE联合槐耳颗粒治疗原发性肝癌可提高客观应答率、疾病控制率以及6 和 12 个月总生存率。Zhao等[4]研究显示TACE联合槐耳颗粒组的6、12个月总生存率(100% vs 90.3%；93.5% vs 80.6%)和肿瘤6、12个月客观应答率(87.1% vs 73.3%；72.4% vs 64.3%)均显著高于单纯TACE组(P值均<0.05)，且联合组行TACE次数明显低于单纯TACE组(P<0.05)，表明槐耳颗粒具有延长TACE治疗间隔时间的作用，这可能与槐耳颗粒具有增强化疗药物的抗肿瘤效果有关。王海瑞等[42]进行的一项前瞻性队列研究显示TACE联合槐耳颗粒能延长肿瘤进展时间，提高临床疗效。一项病例报道[43]显示，1例HCC伴肾静脉-下腔静脉肿瘤栓塞和肺转移的患者自2016年9月9日—2017年8月22日接受载药微球-经肝动脉化疗栓塞术(DEB-TACE)(共3个周期)并联合槐耳颗粒(3次/d，20 g/次，口服)治疗后，AFP降至正常水平，并在2018年4月—2021年3月随访期间发现胸部结节完全消失，肝区、肾静脉和下腔静脉区肿瘤处于完全缓解状态。

2.3 药物联合治疗 近年来，临床上开展的相关研究显示化疗药物或靶向药物联合槐耳颗粒治疗HCC可以明显提高治疗效果，改善患者生存质量和预后。如FolFox4方案联合槐耳颗粒治疗HCC术后复发或转移患者的AFP降低率、生存质量改善率均显著高于单纯化疗组(P值均<0.05)，并且能减少不良反应发生率[5]。

索拉非尼作为治疗晚期肝癌的一线药物，据报道其联合槐耳颗粒能提高临床疗效。张庆辉等[44]研究显示，索拉非尼联合槐耳颗粒治疗原发性肝癌术后复发的疗效显著好于单纯索拉非尼治疗组，槐耳颗粒可显著提高客观应答率(46.7% vs 20%，P<0.05)、疾病控制率(76.7% vs 50%，P<0.05)、1年生存率(60% vs 33.3%，P<0.05)和无进展生存期[(4.77±2.27)个月 vs (3.57±1.78)个月，P<0.05]，降低不良反应发生率(16.7% vs 33.3%，P<0.05)。此外，甄振华等[45]研究显示阿帕替尼联合槐耳颗粒治疗晚期原发性肝癌的有效率为17.1%，疾病控制率为 51.4%，中位无进展生存期和中位生存时间分别为4.5个月和10.4个月，1年生存率为37.1%；但该研究样本量小且缺少对照组，因此阿帕替尼联合槐耳颗粒的疗效值得进一步探索。

Liu等[46]进行的一项大样本量的回顾性研究认为包括槐耳颗粒在内的中医药治疗是HCC患者 5 年生存的独立保护因素(校正HR=0.46，95%CI：0.40～0.52，P<0.000 1)。党志博等[47]研究发现槐耳颗粒是乙型肝炎相关原发性肝癌患者生存的保护因素，且生存时间与用药时间呈正相关。相关Meta分析[48]指出，槐耳颗粒辅助西医疗法的疗效和安全性均优于常规西医疗法。

3 小结与展望

槐耳在HCC治疗中的作用机制包括抑制血管生成、抑制肝癌细胞增殖、抑制侵袭与转移、诱导细胞凋亡、调节免疫功能等，在HCC发生发展进程中对相关靶点与信号通路起到调控作用，关于槐耳抗HCC作用机制的总体概述详见图1。但是，槐耳的成分相当复杂，药理作用非常广泛，如何从多角度、多层次、多靶点对其抗肿瘤作用及机制进行客观、定性定量的研究，尚需更多的实验进行探究。

槐耳颗粒作为一种中成药，具有低毒、服用方便等优点，已被应用于HCC的综合治疗并取得了较好的疗效。虽然目前关于槐耳颗粒的RCT不断增多，但因患者的临床分期或肝功能不同等原因，难以明确其对不同标准下患者的治疗效果。因此，今后本团队欲探讨槐耳颗粒辅助肝切除或热消融对符合米兰标准的HCC患者治疗效果。此外，由于目前大部分为回顾性研究，单中心、样本量小、随机分配方法不明等原因，很多研究证据级别较低。因此未来需要开展多中心、前瞻性、大样本且更加严格控制的各类RCT为临床方案作出指导。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：谢铠岭负责文献查找与整理，撰写文章；徐锋负责拟定写作思路，提供意见，修改文章并最终定稿。

注：TLR4，Toll样受体4；N-cadherin，钙黏蛋白N；E-cadherin，钙黏蛋白E；LaminB1，核纤层蛋白；NOV，肾母细胞过表达基因；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；JNK，c-Jun氨基末端激酶；ERK，细胞外调节蛋白激酶；PI3K，磷脂酰肌醇激酶；AKT，丝/苏氨酸蛋白激酶；AEG-1 shRNA，星形胶质细胞提高基因短发夹RNA；CDK，细胞周期蛋白依赖性激酶；Cyclin，细胞周期调节蛋白；NO，一氧化氮；IL-6，白细胞介素6；COX-2，环氧化酶-2；TNFα，肿瘤坏死因子α；Bcl-2，B淋巴细胞瘤-2基因；BAX，Bcl-2基因家族中的一员；G1、S、G2、M ，细胞周期4个阶段；Cry61，半胱氨酸蛋白61；CTGF，结缔组织生长因子；Runx2，Runx2 家族转录因子2；TEAD2，转录增强缔合域蛋白2；OXA，奥沙利铂 。