紫花地丁果实不同发育时期种子形态与萌发行为初探

陆 倩，魏 岩，安忻蕾，闫紫烟

（新疆农业大学草业学院, 新疆 乌鲁木齐 830052）

植物果实(种子)的二型性(seed dimorphism)或多型性(seed polymorphism)就是指在同一株植物上结出两种或多种类型的形态结构、生理特性等方面存在明显差异的种子的现象，是植物母体遗传特性与环境因素改变共同作用的结果[1]。具有二型性或多型性种子植物的出现，意味着植物在萌发和休眠反应及其他生殖策略上会产生差异，大大地提高了植物在干旱、盐碱地区和扰动强烈地区的生存能力[2]。

紫花地丁(Viola philippica)是堇菜科(Violaceae)堇菜属的多年生植物，同一个植株在不同时期会出现两种形态完全不同的花——开放花(chasmogamous,CH)与闭锁花(cleistogamous, CL)[3-6]，因此能形成二型性种子即CH 种子和CL 种子[7-8]。CH 在早春时期(4 月中到4 月中下旬)开花，花期较短，颜色艳丽呈紫色，观赏价值高；CL 在5 月初到9 月初开花，无花瓣，花期较长，持续开花，持续结实，是极好的园林绿化植物[8-10]。由于其具有持续结实、持续散布种子的特性，会造成种子损失，给种子生产带来困难，必须分批分期进行果实采集，以获取种子。目前关于紫花地丁二型性的研究集中在花部结构性状、授粉机制[10]、繁殖对策、繁殖特征[7]和萌发行为[11-12]上。研究表明紫花地丁新成熟的两种类型种子均具有较高的萌发率[11]，且不同成熟度种子的萌发率不同[12]。关于紫花地丁两种类型果实的发育进程以及不同成熟度种子的形态与萌发特性是否存在差异尚未见报道。

本研究通过观察紫花地丁CH 果实和CL 果实的发育进程，比较两种类型不同成熟度种子的形态特征与萌发特性，弄清果实形态与种子活力的对应关系，为紫花地丁种子确定最佳采摘时期，防止和减少果实开裂造成种子损失提供科学依据。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料与样地

无虫害且发育良好的CH 和CL 紫花地丁果实分别在2020 年5 月初与6 月初采收于准噶尔盆地南缘(43°80′ N，87°56′ E，830 m)，该地区属中温带荒漠区，属中温带大陆性干旱气候[13]，该地5 月日均最高气温24 ℃，日均最低气温13 ℃。6 月份温度上升，日均最高气温29 ℃，日均最低气温19 ℃ (图1)。本研究所用气象资料来源于乌鲁木齐气象局2020年气象资料。

图1 乌鲁木齐5 月和6 月气温日变化Figure 1 Urumqi's daily temperature change in May and June

1.2 研究方法

1.2.1 果实不同发育时期与种子形态

随机选取20 株紫花地丁，分别在每个月月初采用挂牌法对同一天开花状态一致的花进行标记。在花期后进入果期时观测果实发育进程，每天观测一次，果熟期每天观测3 次，直至果实成熟(果实完全直立开裂种子尚未弹出)。记录不同成熟度果实的发育时间并收集果实和种子。

随机选取收集果期不同成熟度的果实和种子各20 粒，设3 次重复。观察其颜色、形状，用游标卡尺测量果柄长度、果实和种子的长度(底部到尖端的长度)和宽度(最宽位置的长度)，测量值精确到0.01 mm，用万分之一电子天平测种子的鲜重和干重，计算含水量。

测定鲜重及干重：将种子剥出，以1 000 粒为一组设4 次重复，称量CH 与CL 不同成熟度种子的重量(鲜重)，自然风干15 d 后测定千粒重(干重)，计算种子含水量[11]。

1.2.2 种子萌发与活力

在25 ℃/35 ℃适宜条件下进行光照处理(黑暗12 h/光照12 h)[14]，选取不同成熟度的紫花地丁CH种子和CL 种子各100 粒，将25 粒种子置于铺有2 张滤纸的培养皿(9 cm)中，4 组重复做相同处理。每24 h 观测一次并记录种子萌发数，以连续5 d 没有种子萌发视为萌发结束。种子萌发试验完成后，计算萌发率、萌发指数、活力指数。

萌发率＝(发芽种子数/供试种子总数) × 100% ；

式中：Gt为在第t天的种子发芽数，Dt为相对应的种子发芽天数。

式中：S为苗长，苗长为试验时间内供试种子的根长+芽长。

1.2.3 数据统计与分析

使用SPSS 20.0 软件对样本数据进行分析，用单因素(one-way ANOVA)和双因素(two-way ANOVA)方差分析验证不同成熟期紫花地丁果实和种子的差异性，显著性水平的判断依据P＜ 0.05。采用GraphPad Prism 6.01 软件绘制图表。

2 结果分析

2.1 不同发育阶段果实和种子的形态特征变化

CH 果实的发育时间长于CL 果实，但果实的发育阶段形态特征相似(表1)，根据不同发育阶段紫花地丁CH 和CL 果实与种子的形态变化，将果实未竖起紧贴果柄呈0°，果实颜色为浅绿色，剥开果皮种子呈白色透明状或乳白色的状态记为Ⅰ期；果实竖起与果柄呈60°，种子呈淡黄色记为Ⅱ期；果实与果柄呈大于60°但未垂直，种子呈黄色记为Ⅲ期；果实与果柄垂直，种子呈棕黄色记为Ⅳ期，在Ⅱ～Ⅳ期果实颜色均为翠绿色；果实竖起未完全直立与果柄呈120°，果实颜色由绿变黄，种子呈浅褐色记为Ⅴ期；果实与果枝呈150°，种子呈褐色记为Ⅵ期；果实直立但未开裂与果柄呈180°，此时果实表皮为灰白色，种子呈黑色记为Ⅶ期；果实直立且刚开裂，但种子尚未弹出此时种子呈黑色记为Ⅷ期，共8 个时期。

CH 和CL 果实成熟度、果实和种子的颜色及种子形态的变化趋势基本一致(表1)。随着发育时间的延长，两种类型果实的果皮颜色由深变浅，种子颜色由浅变深(图2)。对不同成熟两种类型紫花地丁果实种子的形态测定发现，CH 和CL 果实和种子的长宽随着发育时间的延长呈上升趋势且在各时期CH 果实和种子的长宽都比CL 果实和种子大(图3)。CH 和CL 果实的长度和宽度分别为8.0～9.5 mm，7.5～9.0 mm；4.5～6.0 mm，4.0～5.5 mm，均在果实即将开裂前(Ⅶ 期)达最大值分别为9.42、8.98、5.84 和5.42 mm；CH 和CL 种子的长度和宽度变化范围均在1.8～2.0 和1.0～1.25 mm，在各时期种子长度和宽度略有增加但差异不显著(P＞ 0.05)(图3)。

图2 紫花地丁不同成熟度果实及种子形态Figure 2 Fruit and seed morphology of Viola philippica at different maturation stages

图3 紫花地丁CH 和CL 不同成熟度果实及种子的发育特性Figure 3 Developmental characteristics of fruits and seeds of Viola philippica CH and CL at different maturation stages

表1 紫花地丁发育过程中果实与种子颜色及形态变化Table 1 Changes in fruit and seed color and morphology during the development of Viola philippica

2.2 果实的发育进程

2.2.1 CH 果实的发育进程

CH 花期在4 月中到4 月中下旬，幼果经过24～29 d 发育成熟开裂。于2020 年5 月1 日开始观察CH 果实发育进程，此时蒴果完全弯曲紧贴果枝，5 月6 日蒴果竖起且与果柄间夹角约呈60°；5 月8 日至9 日与果柄间角度变大，5 月9 日至15 日期间夹角呈垂直状态；5 月16 日至18 日约呈120° (表1)；5 月19 日到20 日约呈150°；5 月20 日到23 日蒴果直立；5 月24 日至29 日时蒴果陆续开裂，种子弹出。

2.2.2 CL 果实的发育进程

CL 花期从5 月初到9 月初。本试验对6 月CL果实发育进程进行观测，发现花后经过16 d 幼果发育成熟开裂，此后果实持续开裂。2020 年6 月6 日蒴果完全弯曲紧贴果柄；6 月10 日蒴果竖起与果柄间夹角约呈60°；之后果实与果柄的角度变大，6 月15 日果实与果柄垂直；6 月16 日至19 日约呈120°；6 月21 日时约呈150°；6 月22 日早上10 时观测蒴果直立；当天下午7 时时蒴果陆续开裂，种子弹出。

2.3 不同成熟度种子千粒重及含水量

随着紫花地丁种子的发育，CH 种子CL 种子在Ⅰ～Ⅲ粒重显著增加(P＜ 0.05)，Ⅳ期后千粒重趋于稳定差异不显著(P＞ 0.05)。且两种类型种子千粒重均在完全成熟时(Ⅷ期)达到最高，分别为1.16 和1.13 g(图4)。

两种类型种子的含水量随种子发育时间的延长均呈现显著降低的趋势(P＜ 0.05)。当种子完全成熟时(Ⅷ期)，CH 和CL 种子含水量均达到最低值分别为9.18%和4.10%，且CH 种子含水量高于CL 种子(图4)。

图4 不同成熟度紫花地丁CH 与CL 种子的千粒重和含水量Figure 4 Thousand grain weight and water content of different maturation stages of CH and CL seeds of Viola philippica

2.4 不同成熟度CH 种子和CL 种子的萌发特性

随着种子的发育，萌发率逐渐提高，Ⅳ期之后，萌发率超过80%。CH 种子在Ⅴ期时萌发率最高达95%，CL 种子到Ⅷ期萌发率最高达96% (图5)。在成熟度较低情况下(Ⅳ期以前)，两种种子的萌发指数显著提高(P＜ 0.05)。CH 种子的萌发指数在Ⅴ 期时达到最高(24.11)，是CL 种子萌发指数(15.58)的1.55 倍；CL 种子的萌发指数在Ⅷ 期时达到最高(21.95) (图5)。CH 种子的活力指数整体呈现先增加再降低的趋势，而CL 种子的活力指数整体呈现先增加再降低之后再增加的趋势(图5)。两种种子均在Ⅳ期达最高分别为607.20 和635.46，此后保持较高水平(400.00～550.00)。在Ⅱ期～Ⅶ期CH 种子的萌发率和萌发指数均高于CL 种子；在Ⅰ期～Ⅳ期和种子完全成熟时(Ⅷ期) CH 种子的活力指数均低于CL 种子(图5)。

图5 不同成熟度对紫花地丁CH 和CL 种子萌发的影响Figure 5 Effect of different maturation stages on the germination of Viola philippica CH and CL seeds

3 讨论

紫花地丁同一植株上既可形成CH，也能形成CL，这使得植株可产生二型性果实(种子)，CH 果实和CL 果实虽然在颜色、形状、果实与果柄的夹角等发育阶段特征相似，但发育进程时间不同，种子成熟时间也不同，CH 果实成熟时间较CL 果实成熟时间早，而CL 果实发育进程时间明显短于CH 果实，由于6 月温度明显高于5 月温度，所以两种类型果实发育进程时间和种子成熟时间的差异可能与温度有较大关系。CH 与CL 交配系统的不同也可能是导致差异的原因。

根据种子的成熟指标、形态结构以及生理特征的关联性，在适当的时间采收种子，对提高种子产量和品质极为重要[15]。果实和种子的颜色不仅是种子成熟程度的表型指标，也可作为确定种子适宜收获时间的最直观指标[16-18]。一些果实和种子在发育过程中颜色会发生规律性变化。广布野豌豆(Vicia cracca)荚果从盛花后9 d 开始分别由浅绿色变为绿色、棕绿色、棕色，最终变为浅棕色，种子则由绿色、黑绿色最终变为黑色[19]；杭芍(Paeonia lactiflora)果实在成熟过程中果皮由白绿色转至浅绿再变为黄绿色，最后果皮出现褐色斑块，种子颜色由黄色变为米黄色、橘黄色变为黄褐色，最终变为黑褐色[20]；羊草种子 (Leymus chinensis) 在发育期间，稃与种子的颜色也均随着种子成熟度的提高而不断的变化[17]。本研究中紫花地丁随着果实的发育，果实与果柄间夹角不断增大，果皮和种子颜色也随成熟度的增加而呈规律性变化。在幼果时期(Ⅰ)为浅绿色，种子为乳白色；果实刚成熟时呈翠绿色(Ⅱ - Ⅳ)，种子颜色变深；果实成熟时呈灰白色(Ⅴ - Ⅷ)，种子最终变为黑色。

千粒重能直接反映出种子积累干物质的程度，通常千粒重越大，种子品质越好[17-21]。因此千粒重大、品质高的CH 种子能为物种的生存和更新提供条件[22]。随着种子的不断成熟，紫花地丁在Ⅳ期之后CH 和CL 种子千粒重和含水量基本稳定，在Ⅷ期时千粒重达到最大，此时含水量对应最小，说明此时种子干物质的积累达到最大，成熟度最高。

种子的成熟度影响种子萌发率、萌发势、活力，甚至幼苗生长等综合指标[23]。种子萌发特性与采收时间和气候条件等密切相关。郝楠等[24]发现，采收时间可能会影响种子的成熟度，进而影响种子的萌发水平。因此，可以通过种子成熟时种子萌发指标的变化来确定合适的收获时间。随着成熟度的增加，羊草种子的萌发率基本呈现出先增加后降低的趋势，在盛花期后33 d 基本达到最高值[25]；伴随扁穗雀麦(Bromus cartharticus)种子的发育，其内在干物质积累存在渐进过程，在盛花后32～36 d 时“江夏”扁穗雀麦种子萌发率、萌发势、萌发指数和活力指数均达最高，“黔南”范围较之稍宽，为花后32～42 d[26]。本研究中在Ⅱ期～Ⅶ期的CH 种子的萌发率和萌发指数均高于CL 种子，此结果与苏雪等[11]、孙慧芳等[14]对紫花地丁CH 和CL 种子萌发特性的研究结果一致，同属于堇菜属的维西堇菜 (Viola monbeigii)也表现出CH 种子萌发率高于CL 种子萌发率的现象[27]。虽然紫花地丁产生的CH 种子总量少，但因其具备更高的萌发率，能产生遗传多样性丰富的种子，因此具有较高适合性，能更好的适应环境[28]。种子的成熟度与种子活力密切相关，王利等[29]通过对5 个常规粳稻品种的种子质量进行研究，结果显示种子的萌芽率和活力随成熟度的增加而升高，后随发育时间的延长，种子会因环境条件的影响发生劣变和老化，导致萌芽率和活力出现极显著水平降低。周海宁[30]通过对不同杂交玉米(Zea mays)的研究结果表明，玉米种子的萌芽率、萌芽势、萌芽指数和活力指数等与种子活力密切相关的指标均随着成熟度的增加逐渐升高并趋于稳定，且不同成熟度种子间的活力差异显著。随着种子生长发育时期的不断延长，种子活力达到最大值后，又随着采收过迟而呈现下降趋势[31-32]。因此种子活力是随着种子成熟度的增加而增加，过早收获会导致活力低，但成熟度越高，种子活力也并非越高[33]。本研究中两种种子的萌发率、萌发指数和活力指数达最高值后随发育时间的继续延长，也出现下降趋势但萌发指标仍能达到较高水平。

4 结论

根据果实不同发育阶段的形态特征将紫花地丁果实(种子)划分为8 个时期。从Ⅳ期之后果皮颜色由深变浅，由翠绿变灰白，果实内种子颜色由浅变深，由深黄变黑。果实成熟后果皮开裂，两种类型种子的散布均为远距离弹力散布，利于种群扩建但不利于种子收获，应提前收获。紫花地丁CH 果实的发育时间长于CL 果实，其果实的大小，果柄长及种子的大小、千粒重，含水量均大于CL 果实及种子。CH种子的萌发率和萌发指数均高于CL 种子。随着果实的发育，两种类型种子的千粒重呈先显著上升后稳定的趋势，在Ⅳ期后种子萌发率、萌发指数和活力指数达最高值后有下降趋势，但仍能达相对较高水平。在生产上，Ⅳ期之后，果实与果柄间夹角大于90°，果实颜色发黄或呈灰白色时，都可进行采收。