多聚磷酸盐促进肌腱干细胞增殖和能量代谢的体外研究△

雷昌斌，唐新文，郭志文，李 健

（湘南学院附属医院临床医学研究中心，湖南 郴州 423000）

肌腱病（tendinopathy）是临床的常见病及多发病，全球每年约新增3 000万肌腱病患者，严重影响人们日常生活及活动［1］。传统治疗方案包括局部制动、非甾体类药物消炎止痛、超声波激光及局麻药+激素（封闭治疗），对一些慢性、顽固性的肌腱炎也可采取手术或关节镜等微创治疗，但治疗效果均有限，修复后肌腱质量变差，容易引起粘连和纤维化，甚至断裂。近年发现分离肌腱干细胞（tendon stem cells）约占肌腱组织5%左右，肌腱干细胞具有成肌腱、成脂肪、成骨等多向分化潜能［2］。肌腱干细胞可以向损伤部位聚集并向肌腱细胞方向分化，对损伤的肌腱组织修复有非常重要的作用［3］。但移植肌腱干细胞通常需要对其培养增殖以获得足够数量，但目前尚无较好办法能在体外长期培养中保持干细胞稳定性并控制其分化方向。

多聚磷酸盐（inorganic polyphosphate,Poly P）是由几个至数百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体，释放出来的能量可参与氨基酸、核苷酸、糖和脂类等主要分子的构建［4］。Poly P是细胞除DNA和RNA后的第三大主要多聚体阴离子（polyanion）［5］。研究认为Poly P在原核和真核生物中具有促进细胞修复和分化成熟［6］、增殖［7］、促进凝血酶活性［8］及清除氧自由基［9］等作用，但对高等哺乳动物的影响尚不清楚。研究证实，Poly P可以通过上调椎间盘髓核细胞基质的表达，从而提高髓核细胞的合成代谢［10］。本研究通过CKK-8细胞增殖、细胞周期实验和ATP能量检测试剂盒检测不同浓度Poly P对肌腱干细胞增殖和能量代谢的影响，并通过Western blot和免疫荧光检测I型胶原的表达差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

3个月龄SD（Sprague-Dawley）成年雌性大鼠，动物实验通过湘南学院附属医院实验动物伦理委员审查和审批，并严格遵守其相关指南。培养基：DMEM（Life Technologies，美国）；10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（ATLANTA，美国），1%青链霉素（Gibco，美国）。抗体：CD44、CD90.1、CD45和CD106（Proteintech，中国），Collagen type I（abcam，美国），β-actin（Affinity，中国）；消化酶：Collagenase type I(Gibco，美国)、Dispase II（Roche，美国）；试剂盒：CCK-8试剂盒（索莱宝公司，中国），ATP试剂盒（PerkinElmer，美国）。其他常规试剂和耗材购自长春宝泰克生物科技有限公司。

1.2 细胞分离与培养鉴定

用CO2安乐处死大鼠后，在无菌操作台上分离大鼠髌腱组织，用无菌剪刀剪碎后，按照每100 mg组织加入1 ml PBS消化液，其中含3 mg Collagenase typeⅠ和4 mg Dispase II，37°C下消化2 h，悬液在2 500 r/min离心5 min，弃上清，再次加入PBS液10 ml，混匀后再次在2 500 r/min离心5 min，弃上清，然后加入培养基（DMEM,20%FBS,1%P/S）5 ml，将悬液转移至T25培养瓶中，置于37°C CO2培养箱中培养。约两周后，用结晶紫对细胞克隆进行染色，待细胞长至整瓶70%～80%后，消化细胞，进行CD44、CD90.1、CD45和CD106免疫染色，采用流式细胞仪进行分析。

1.3 体外处理

将P2代肌腱干细胞按3 000 cells/well接种至96孔板，待细胞贴壁后，分别加入0、0.5、1.0 mmol/L Poly P培养。

1.4 检测指标

1.4.1 细胞增殖能力测定

细胞分别培养1、4、8、24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h，使用酶标仪检测450 nm的吸光度（Optical density,OD）。

1.4.2 细胞周期测定

细胞培养48 h后，消化细胞，进行PI染色，并采用流式细胞仪对细胞周期进行分析。

1.4.3 ATP能量代谢检测

细胞分别培养1、4、8、24 h后，用ATP试剂盒配置浓度梯度，每孔加入50 μl mammalian cell lysis solution避光并震动5 min，再每孔加入50 μl substrate solution避光震动5 min。使用酶标仪测定450 nm吸光度（OD），检测了ATP浓度（nM），后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit测定每孔样品总DNA含量（ng），并将产生的APT（nM）量标准化每孔总DNA含量（nM/ng）。

1.4.4 免疫荧光和Western blot检测I型胶原的表达

免疫荧光检测I型胶原的表达，如上不同浓度Poly P处理细胞48 h后，将细胞用预冷的PBS浸洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定细胞10 min，PBS浸洗3次，每次3 min，然后加入一抗I型胶原（1∶200）并放入湿盒，4℃孵育过夜。第2 d用PBS清洗3遍，每次3 min，加入荧光二抗，室温孵育1 h，PBS清洗3遍，每次3 min，然后加入DAPI避光孵育5 min，PBS清洗3遍，每次3 min，最后在荧光显微镜下观察并采集图像。

细胞培养48 h后，用RIPA裂解液裂解细胞，提取各组总蛋白后用BCA试剂盒检测蛋白浓度，然后进行Western blot检测I型胶原的表达，使用4%～20%梯度聚丙烯酰胺凝。进修电泳、转膜后，室温下在5%的脱脂牛奶封闭1 h。分别加入一抗I型胶原（1∶1 000）在4°C摇摆平台上过夜。第2 d用TBST缓冲液清洗3遍之后在室温下加入二抗（1∶10 000）并避光摇晃1 h，再洗涤3次，使用奥德赛成像仪对蛋白条带进行化学显色，并用Image J软件进行半定量分析。

1.5 统计学方法

采用Graphpad Prism7.03软件进行统计学分析，重复3次的独立实验所得实验数据以±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肌腱干细胞的鉴定

从大鼠肌腱分离肌腱细胞约2周后，可见细胞克隆（图1a），对其进行结晶紫染色（图1b），然后采用流式细胞术对其表面分子表达进行鉴定，发现＞95%的细胞均表达CD44和CD90.1，几乎不表达CD45和CD106（图1c～1f），提示作者成功分离得到大鼠肌腱干细胞。

图1 大鼠肌腱干细胞的鉴定 1a:大鼠原代肌腱细胞呈成纤维细胞样形态，培养约12 d后，可见大量圆形细胞克隆 1b:细胞克隆结晶紫染色结果 1c～1f:大鼠肌腱细胞表面分子鉴定，这些细胞表达间充质干细胞表面标记物CD44和CD90.1，但白细胞表面标记物CD45和血管内皮细胞标记物CD106均为阴性

2.2 多聚磷酸盐对肌腱干细胞增殖和细胞周期的影响

CCK-8细胞增殖检测结果见表1。随着培养时间的推移，三个浓度Poly P组的OD值均显著增加（P＜0.05）。Poly P可以促进大鼠肌腱干细胞的增殖，且呈浓度依赖性，培养1 h时，三个浓度Poly P组间差异无统计学意义（P＞0.05），但是培养4～24 h，三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 CCK-8检测结果（OD值，n=3，±s）与比较

表1 CCK-8检测结果（OD值，n=3，±s）与比较

时间点1 h 4 h 8 h 2 4 h P值0 m m o l/L 1.1 3±0.0 7 1.2 2±0.0 7 1.4 6±0.0 5 2.2 7±0.0 4＜0.0 0 1 0.5 m m o l/L 1.1 3±0.0 3 1.3 7±0.0 2 1.9 1±0.0 3 2.6 4±0.0 5＜0.0 0 1 1.0 m m o l/L 1.1 8±0.0 8 1.4 4±0.0 4 2.0 5±0.0 7 3.3 1±0.0 7＜0.0 0 1 P值0.3 1 7＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

细胞周期检测结果见图2。结果表明：Poly P可以提高细胞G2+S期的百分比，从而促进细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 细胞周期流式细胞仪检测结果 2a:对照组 2b:0.5 mmol/L Poly P处理48 h后 2c:1.0 mmol/L Poly P处理48 h后，可见随Poly P浓度增加，G2+S的占比显著增加

2.3 多聚磷酸盐对肌腱干细胞能量代谢的影响

多聚磷酸盐对肌腱干细胞能量代谢ATP检测结果见表2。随培养时间的推移，三个浓度Poly P组的ATP检测的标准值均显著增加（P＜0.05）。Poly P可以促进大鼠肌腱干细胞的ATP的合成，且呈浓度依赖性；培养1 h，三个浓度Poly P组间ATP检测的比值差异无统计学意义（P＞0.05），但是培养4～24 h，三组间ATP检测的比值差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 能量代谢ATP定量检测结果（nM/ng，n=3，±s）与比较

表2 能量代谢ATP定量检测结果（nM/ng，n=3，±s）与比较

时间点1 h 4 h 8 h 2 4 h P值0 m m o l/L 4 8 4.7 8±5 3.6 9 4 2 6.5 3±8 7.4 9 5 2 2.0 3±2 7.2 5 6 2 2.6 8±8 5.4 6＜0.0 0 1 0.5 m m o l/L 5 1 9.4 5±8 3.1 6 4 8 9.1 8±3 7.0 9 6 0 2.9 4±7 6.5 3 8 0 4.9 6±9 0.0 6＜0.0 0 1 1.0 m m o l/L 5 0 7.2 7±5 3.0 9 5 4 5.8 3±8 5.0 7 6 4 2.0 6±9 1.3 1 7 5 2.0 6±8 7.4 2＜0.0 0 1 P值0.6 5 1 0.0 4 2 0.0 2 9 0.0 0 8

2.4 多聚磷酸盐对肌腱干细胞基质代谢的影响

免疫荧光染色所见Poly P促进大鼠肌腱干细胞I型胶原的表达见图3a～3c，可见随Poly P的增加，荧光显色强度显著增加。

Western blot检测结果见图3d，此检测进一步印证了免疫荧光染色的检测结果，Western blot检测结果半定量的直方图见图3e，表明0.5 mmol/L、1.0 mmol/L的Poly P组较0 mmol/L Poly P组的I型胶原的表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 Poly P对大鼠肌腱干细胞I型胶原表达的影响 3a～3c:免疫荧光检测I型胶原的表达，可见随Poly P的浓度增加，荧光强度增加，说明I型胶原的表达升高 3d:Western blot检测I型胶原的表达 3e:Western blot半定量分析实验结果，*表示实验组与对照组比较P＜0.05，#表示1.0 mmol/L组与0.5 mmol/L组比较P＜0.05

3 讨论

肌腱病都是慢性损伤所引起的，属于无菌性炎症，导致肌腱附着点局部疼痛，尤其是在受力及负重时加重［11］。肌腱组织自身再生能力差，自我愈合后形成的纤维瘢痕组织生物化学和机械性能差，容易再损伤甚至断裂。肌腱干细胞具有成肌腱、成骨、成脂肪等多向分化能力，最近研究发现肌腱干细胞可有效修复肌腱损伤［12］。文献报道将间充质干细胞注射到关节腔内，在体内微环境的作用下，可以迁移到受损部位分化出新的软骨细胞和成骨细胞，对退变性关节炎半月板及软骨进行重建［13,14］。但移植肌腱干细胞通常需要对其培养增殖以获得足够数量，但目前尚无较好办法在长期培养中保持干细胞稳定性。本研究探讨Poly P对哺乳动物肌腱干细胞的影响，有助于肌腱干细胞的临床应用。

本研究证实，不同浓度的Poly P可以促进体外肌腱干细胞的增殖，其中1.0 mmol/L Poly P较0.5 mmol/L Poly P促进肌腱干细胞增殖更加明显。Carney［15］报道在富含血小板血浆中（Platelet-Rich Plasma,PRP），Poly P可以促进伤口上皮细胞化生，促进伤口的愈合。同样Gawri［10］通过对牛椎间盘髓核组织细胞体外培养证实，Poly P可以加速髓核细胞的增殖和组织分化。因此Poly P可以促进体外肌腱干细胞的增殖，有利于肌腱干细胞的体外培养。

Poly P在其共价键中储存能量，可释放用于细胞生成氨基酸、核苷酸、糖和脂肪的基本分子结构单元［5,16］。Poly P是体内能量代谢储存库，当细胞或微生物体内有较高含量的ATP，可以促进多聚磷酸激酶K生成Poly P。相反，当细胞或微生物体内ATP减少时，腺苷激酶被抑制，外切聚磷酸酶被激活，可以降解Poly P为ATP［17］。本研究证实，0.5 mmol/L、1.0 mmol/L Poly P可以增加肌腱干细胞的ATP生成，并且在4、8、24 h ATP生成与0 mmol/L Poly P相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

作者通过检测肌腱干细胞基质蛋白CollagenⅠ的表达，发现不同浓度的Poly P可以促进肌腱干细胞CollagenⅠ的表达，并且1.0 mmol/L Poly P相较于0.5 mmol/L浓度下能进一步促进其表达。这与本团队前期研究Poly P可以促进人体椎间盘纤维环细胞ATP能量代谢和调节细胞基质代谢的结论一致［18］。因此Poly P可以促进肌腱干细胞向成肌腱方向分化，有助于其在肌腱病临床中的应用。Poly P在不同物种、细胞结构中还有一些其他的功能：包括线粒体络合钙离子、镁离子等重离子，提供磷酸根储备库、缓冲碱性压力，协助细菌转化，调控细胞生长、发育及应急等［19，20］。研究还发现Poly P可参与细胞的生理代谢调节，包括核仁DNA转录，线粒体通透性，同时在促炎症、凝血、骨化过程中也有一定的作用［21，22］。

临床分离和检测Poly P仍是瓶颈，需要更简便、准确的方法。目前已知Poly P可以促进体外肌腱干细胞的增殖和能力代谢，但其具体功能和机制尚不明确，仍有待于进一步的深入研究。