血清IL-17及其基因-197A/G位点基因多态性与酒精性肝病易感性的关系

盖楠

【摘要】 目的：分析血清白介素-17（interleukin-17，IL-17）及其基因-197A/G位点的单核苷酸多态性与酒精性肝病易感性的关系。方法：选擇于2019年3月-2020年3月在朝阳市第四医院治疗的120例酒精性肝病患者为研究对象。根据疾病情况将患者分为脂肪肝组（n=37），肝硬化组（n=52）及肝癌组（n=31）。另选取同期在本院体检的60例健康成年人为对照组。利用ELISA法检测四组的血清IL-17水平，利用DNA提取试剂盒提取血清总DNA，采用聚合酶链式反应-连接酶检测反应（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR）检验IL-17的197A/G基因多态性。对比四组的血清IL-17水平、基因型差异;分析酒精性肝病与血清IL-17、197A/G基因型相关性。结果：四组血清IL-17水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）;肝癌组、肝硬化组、脂肪肝组IL-17水平均高于对照组，肝癌组高于肝硬化组、脂肪肝组，肝硬化组高于脂肪肝组，差异均有统计学意义（P<0.05）。IL-17 197A/G位点基因型分为三种，分别为AA、AG、GG。肝硬化组和肝癌组AA、AG基因型的分布比例均高于脂肪肝组和对照组，而肝硬化组和肝癌组GG基因型的分布比例均低于脂肪肝组和对照组（P<0.05）。肝硬化组和肝癌组中均等位基因A频率高于脂肪肝组和对照组，而等位基因G频率均低于脂肪肝组和对照组（P<0.05）。Spearman相关性分析显示，酒精性肝病与血清IL-17水平呈正相关（r=0.734，P<0.05），与197A/G位点基因型呈负相关（r=-0.682，P<0.05）。结论：IL-17水平和酒精性肝病进展呈一定的相关性，且A等位基因和AA基因型在IL-17 197A/G位点位置是酒精性肝病发生恶化的易感基因，临床可根据该位点的基因型预防酒精性肝病进展。

【关键词】 白介素-17 197A/G位点 单核苷酸多态性 酒精性肝病 易感性

Relationship between Serum IL-17 Level and Its Gene-197A/G Locus Gene Polymorphism and Susceptibility to Alcoholic Liver Disease/GAI Nan. //Medical Innovation of China， 2022， 19（01）： -136

[Abstract] Objective： To explore the relationship between serum IL-17 level and its gene-197A/G single nucleotide polymorphism and susceptibility to alcoholic liver disease. Method： A total of 120 patients with alcoholic liver disease who were treated in Chaoyang Fourth Hospital from March 2019 to March 2020 were selected as the research objects. They were divided into fatty liver group （n=37）， cirrhosis group （n=52） and liver cancer group （n=31） according to disease conditions. Another 60 healthy adults in our hospital were selected as the control group. The serum IL-17 levels of the four groups were detected by ELISA， the total DNA was extracted by DNA extraction kit， and gene-197A/G single nucleotide polymorphism was detected by polymerase chain reaction-ligase detection reaction （PCR-LDR）. The serum IL-17 levels and genotypes of the four groups were compared. The correlation between alcoholic liver disease and serum IL-17， 197A/G genotype was analyzed. Result： There was statistical significance in serum IL-17 level among the four groups （P<0.05）. The IL-17 levels of liver cancer group， liver cirrhosis group and fatty liver group were higher than that of control group， liver cancer group was higher than those of liver cirrhosis group， fatty liver group， liver cirrhosis group was higher than that of fatty liver group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The genotypes of IL-17 197A/G locus were divided into AA， AG and GG， respectively. The distribution proportions of AA and AG genotypes in liver cirrhosis group and liver cancer group were higher than those in fatty liver group and control group， while the distribution proportions of GG genotypes in liver cirrhosis group and liver cancer group were lower than those in fatty liver group and control group （P<0.05）. The frequency of allele A in liver cirrhosis group and liver cancer group were higher than those in fatty liver group and control group， while the frequency of allele G were lower than those in fatty liver group and control group （P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that alcoholic liver disease was positively correlated with serum IL-17 level （rs=0.734， P<0.05）， and negatively correlated with 197A/G locus genotype （rs=-0.682， P<0.05）. Conclusion： IL-17 level is correlated with the progression of alcoholic liver disease to a certain extent， and A allele and AA genotype at 197A/G site of IL-17 are susceptibility genes for the progression of alcoholic liver disease， which can be clinically prevented according to the genotype at this site.

[Key words] IL-17 197A/G locus Single nucleotide polymorphism Alcoholic liver disease Susceptibility

First-author’s address： Chaoyang Fourth Hospital， Liaoning Province， Chaoyang 122000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.01.033

酒精性肝病作為一种长时间过量饮酒引起的肝脏损伤性疾病，和正常人群相比，长期过量饮酒者的病死率超过正常人群的2倍左右，其中神经系统和肝脏相关疾病的发病率较正常人群至少高2成[1]。目前，临床研究发现酒精性肝病的发病过程需要经过三个阶段，其中仅酒精性脂肪肝是可通过治疗逆转病理学改变，让患者恢复健康;酒精性肝硬化则无法通过治疗来逆转肝脏的病理学改变，预后不良;接近15%酒精性肝硬化患者随着病情的发展会转化为肝细胞癌[2-4]。因此，早期诊断并治疗酒精性肝病对于患者恢复健康，防止肝硬化，甚至肝癌的产生意义重大。据报道，通过对小鼠肝癌模型研究发现，敲除IL-17A基因和IL-17A信号通路的药物阻断可明显将酒精诱导的小鼠肝癌生长进行抑制，说明IL-17信号通路可以作为治疗酒精性肝癌新靶点[5]。此外，IL-17水平及其基因位点的多态性和酒精性肝病之间存在一定的相关性，且不同区域、不同人群的IL-17单核苷酸多态性存在差异[6]。本研究通过分析分析血清IL-17水平及其基因-197A/G位点单核苷酸多态性与酒精性肝病易感性的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月-2020年3月在辽宁省朝阳市第四医院治疗的120酒精性肝病患者为研究对象，纳入标准：（1）符合文献[7]中相关诊断标准，至少五年不间断的过量饮酒（男性乙醇饮用量至少40 g/d、女性至少20 g/d）或2周内乙醇饮用量超过80 g/d;（2）无明显临床症状或出现乏力、右上腹的胀痛、体质量下降、食欲不振等，伴随着病情的发展，有肝掌、蜘蛛痣和精神异常等表现;（3）血清转氨酶水平升高;（4）表现出弥漫性脂肪肝诊断标准。排除标准：（1）肝脏病变已经处于终末期，实施肝移植手术;（2）合并乙肝等病毒性感染;（3）伴有药物性肝病;（4）伴有恶性肿瘤;（5）合并严重的脏器损伤;（6）合并全胃肠外营养等引发脂肪肝的疾病。其中男99例，女21例;年龄28～78岁，平均（49.3±10.5）岁。根据疾病情况将患者分为脂肪肝组（n=37），肝硬化组（n=52）及肝癌组（n=31）。另选取同期在辽宁省朝阳市第四医院体检的60例健康成年人为对照组。纳入标准：长期过量饮酒;肝功能各项指标均正常;肝脏影像学检查并未出现任何异常;排除标准：存在酒精性肝病家族史。所有纳入对象均知情同意，本研究经辽宁省朝阳市第四医院伦理委员会批准。

1.2 血清IL-17检测 于清晨抽取空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上层血清。采用ELISA法检测，试剂盒均来自南京基蛋生物科技有限公司，检测设备为美国THERMO Varioskan Flash 4.00.52多功能酶标仪;设置空白孔、标准品孔和样本孔，依次加样本和抗体，37 ℃孵育1 h，去除上层液体，重复洗涤3次，最后加入底物，37 ℃避光反应15 min。490 nm处利用酶标仪检测其吸收值，利用标准曲线算出IL-17的相对表达量。

1.3 IL-17 197A/G单核苷酸多态性检测 利用DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）提取血清总DNA，然后利用PCR-LDR（连接酶检测反应）检验IL-17 197A/G单核苷酸基因多态性，扩增引物：上游引物为5’-AACAAGTAAGAATGAAAAGAGGACATGGT-3’，下游引物为5’-CCCCCAATGAGGTCATAGAAGAATC-3’，延伸引物为TACCCTTGCTAAGGCTTCTTGCCGA。具体操作如下：引物和探针由上海百研生物科技公司完成合成，将DNA样本稀释至10 ng/μL后加1 μL至反应体系（包含引物混合物1 μL，Master mix 5μL和3 μL ddHO）。置入PCR仪，94 ℃下2 min变性后，进行11个94 ℃（20 s）-65 ℃（40 s）-72 ℃（60 s）的循环，在进入94 ℃（20 s）-59 ℃（30 s）-72 ℃（90 s）的24个循环，最后72 ℃ 120 s。随后加入1 μL Exol/SAP酶，37 ℃下恒温1 h后灭活。使用试剂盒进行双链接反应，将稀释后的连接产物送上海生工生物公司测序，使用DNAman 9.0分析数据;并分析酒精性肝病与血清IL-17、197A/G位点基因型相关性。

1.4 统计学处理 使用SPSS24.0软件进行统计学分析，所有数据进行双侧检验，符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验;计数资料以率（%）表示，比较采用χ检验;相关性采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组一般资料比较 脂肪肝组男30例，女7例;年龄30～78岁，平均（50.3±10.2）岁。肝硬化组男43例，女9例;年龄29～76岁，平均（49.8±10.3）岁。肝癌组男26例，女5例;年龄30～77岁，平均（50.1±10.0）岁。对照组男41例，女19例;年龄31～73岁，平均（50.5±10.3）岁。四组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 四组IL-17水平比较 肝癌组IL-17水平为（37.48±5.14）ng/L;肝硬化组IL-17水平为（29.45±5.04）ng/L;脂肪肝组IL-17水平为（22.05±3.85）ng/L;对照组IL-17水平为（15.38±3.04）ng/L，四组比较差异有统计学意义（F=15.681，P=0.000）;肝癌组、肝硬化组、脂肪肝组IL-17水平均高于对照组（q=25.770、18.154、9.469，P=0.000），肝癌组高于肝硬化组、脂肪肝组（q=6.970、14.137，P=0.000），肝硬化组高于脂肪肝组（q=4.723，P=0.000）。

2.3 四组IL-17 197A/G位点基因型分布 IL-17 197A/G位点基因型分为三种，分别为AA、AG、GG。四组IL-17 197A/G位点基因型分布比较，差异均有统计学意义（χ=30.217，P=0.000）。肝硬化组和肝癌组AA、AG基因型的分布比例均高于脂肪肝组和对照组，而肝硬化组和肝癌组GG基因型的分布比例均低于脂肪肝组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.4 四组IL-17 197A/G位点基因频率分布 四组IL-17 197A/G位点基因频率分布比较，差异均有统计学意义（χ=45.218，P=0.000）。肝硬化组和肝癌组中均等位基因A频率高于脂肪肝组和对照组，而等位基因G频率均低于脂肪肝组和对照组（P<0.05）。见表2。

2.5 IL-17 197A/G位点基因型与酒精性肝病的相关性分析 定义：健康人群=1，脂肪肝=2，肝硬化=3，肝癌=4，酒精性肝病与血清IL-17水平呈正相關（r=0.734，P<0.05）。定义：AA=1，AG=2，GG=3，酒精性肝病与197A/G位点基因型呈负相关（r=-0.682，P<0.05）。

3 讨论

酒精性肝病是长时间摄入大量乙醇造成的一种慢性肝脏疾病。我国作为酒文化大国，酒桌文化盛行，酒精肝逐渐成为肝硬化、肝癌主要诱因。目前，临床上关于酒精性肝病发病机制研究较多，其中酒精性脂肪肝发展到肝硬化的本质是肝脏持续性损伤造成肝细胞修复期间不断地坏死、再生，导致增生的间质纤维结缔组织让肝脏结构、功能改变，这期间乙醇等会通过氧化应激、毒性作用、免疫介导、脂质过氧化以及细胞凋亡等方式加速肝脏细胞损伤[8-10]。IL-17是由Th17细胞诱导产生的一种炎性因子，其可刺激内皮细胞、上皮细胞产生其他炎性因子和趋化因子等，引起组织损伤[11]。Akbulut等[12]研究发现，Th17通路在酒精性肝病中的发展中具有重要作用，肝细胞损伤程度和IL-17的水平呈正相关，且酒精中毒和酒精性肝硬化患者的IL-17水平较正常人明显升高。

本研究发现肝癌组IL-17水平均高于其他三组，肝硬化组高于脂肪肝组和对照组，脂肪肝组高于对照组（P<0.05）。说明IL-17异常升高在酒精肝病情进展中起到重要作用。其原因可能是长期大量的摄入乙醇导致IL-17水平上升，刺激肝星状细胞分泌TNF-α、TGF-β等细胞因子，激活细胞凋亡蛋白酶，诱导肝细胞凋亡，加速疾病的进展[13-16]。本研究通过分析不同阶段酒精性肝病患者IL-17 197A/G位点基因多态性，结果发现肝硬化组和肝癌组AA、AG基因型比例和等位基因A的频率均高于脂肪肝组、对照组，而肝硬化组和肝癌组GG基因型比例和等位基因G的频率均低于脂肪肝组、对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。这说明了人群中酒精性肝病发展的遗传背景存在一定的差异，AA基因型和A等位基因患者更容易发生酒精肝，且在不可逆性的酒精性肝损伤中发挥重要作用[17-19]。李莹等[20]研究亦发现197A/G位点AA基因型会增加病毒性肝炎的风险，但是对于携带该基因型的患者酒精肝进展机制目前还有待进一步研究。

综上所述，IL-17水平和酒精性肝病进展呈一定的相关性，且IL-17 197A/G位点的AA基因型和A等位基因频率更高的患者容易出现酒精肝，临床可根据该位点的基因型预防酒精性肝病的发生、发展。然而，本研究由于样本量和样本来源的限制，需进一步扩大样本及样本范围，进一步分析酒精性肝病易感基因，并分析其可能的机制。

参考文献

[1] SEITZ H K，BATALLER R，CORTEZ-PINTO H，et al.

Alcoholic liver disease[J].Nat Rev Dis Primers，2018，4（1）：16.

[2]孙韬华，刘振胜，辛永宁.酒精性肝病治疗研究进展[J].实用肝脏病杂志，2019，22（2）：156-159.

[3]翁丽媚，王炳元.酒精性肝病的临床评估[J].实用肝脏病杂志，2017，20（1）：7-9.

[4]李秀姿，廖衍强，吕庆良.凝血四项检测在酒精性肝病诊断和分期中的应用价值研究[J].实用中西医结合临床，2017，17（3）：14-15.

[5]丁梦梦，高沿航.IL-17信号通路在酒精相关性肝癌发生、发展中的作用[J].肝脏，2020，25（6）：562-564.

[6] BAO L，YIN J，GAO W，et al.A long-acting FGF21 alleviates hepatic steatosis and inflammation in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis partly through an FGF21-adiponectin-IL17A pathway[J].Br J Pharmacol，2018，175（16）：3379-3393.

[7]中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组，酒精性肝病防治指南（2018更新版）[J].现代医药卫生，2018，34（6）：959-964.

[8]艾迎春，屈元婷，迟男男.血清脂联素、IL-17在非酒精性脂肪性肝病中表达水平变化的研究[J].黑龙江医药科学，2019，42（5）：42-43，46.

[9]李结周，陈舒苑.非酒精性脂肪性肝病患者肠道菌群变化与IL-10、IL-17和IL-23的相关性[J].中国微生态学杂志，2019，31（11）：79-82.

[10]贾益科.酒精性肝病患者血清白介素-8水平测定的临床价值[J].临床医学研究与实践，2018，3（14）：93-95.

[11]赵春娟，张静，杨艳，等.Th17及相关细胞因子与酒精性肝硬化患者肝脏硬度值，肝功能及脂联素水平的相关性分析[J].现代生物医学进展，2020，20（22）：113-116.

[12] AKBULUT U E， EMEKSIZ H C， CITLI S，et al. IL-17A，MCP-1，CCR-2，and ABCA1 polymorphisms in children with non-alcoholic fatty liver disease[J].J Pediatr，2019，95（3）：350-357.

[13]姜楠，劉威龙，乐晓华.肝癌患者血清中细胞因子TNF-α、IL-10、TGF-β1的水平的表达意义[J].医学检验与临床，2018，29（3）：1-3.

[14]尹春英，侯志平，王春青，等.酒精性肝病患者血清IL-17水平变化及其197 A/G位点单核苷酸多态性分析[J].山东医药，2020，60（26）：51-53.

[15]洪文忠，李奕萍.血清γ-GT、CHE、Apelin及内脂素水平在非酒精性脂肪肝患者中的诊疗价值[J].中华全科医学，2020，18（3）：463-466.

[16]孙成山，曾显坤，党彤，等.慢性酒精中毒性肝病干预治疗CDT及血清酶学临床分析[J].中国继续医学教育，2018，10（1）：71-73.

[17]陈燕屏，黄绍强，邓鑫，等.硫普罗宁联合多烯磷脂酰胆碱治疗酒精性肝病患者疗效及血清TLR4、MD-2和TGF-β1水平变化[J].只用肝脏病杂志，2021，24（1）：67-70.

[18]楼海峰，施晓英，方兴.血清Irisin水平与非酒精性脂肪性肝病的相关性研究[J].中国中西医结合消化杂志，2017，25（8）：607-611.

[19]张进，张海.Fibroscan技术联合血清骨钙素在绝经后女性非酒精性脂肪肝病患者中的应用[J].肝脏，2020，25（9）：975-977.

[20]李莹，廖宇圣，孙圣斌，等.血清IL-17与IL-17-197A/G位点单核苷酸多态性和乙型病毒性肝炎易感性研究[J].中华医院感染学杂志，2020，30（11）：1647-1650.

（收稿日期：2021-05-17） （本文编辑：田婧）