PCR仪的分类及校准方法分析

张永臣 周彤 / 黑龙江省计量检定测试研究院

0 引言

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，简称PCR）仪利用PCR技术对特定DNA分子进行体外快速扩增及分析，是一种广泛应用于分子生物学领域的仪器。该技术可将微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，其原理为在一个标准的反应体系中重复完成以下三个步骤：模板DNA的变性（温度场90～96 ℃）、模板DNA与引物的退火45～65 ℃、引物的延伸55～75 ℃。每一次扩增需在指定温度场下完成，即DNA的体外扩增需要通过一台精密温度控制仪完成。1988年美国Cetus公司推出了第一台PCR自动热循环仪，开创了PCR自动化进程。随着PCR技术的不断发展，在传统PCR仪基础上增加信号采集系统和数据分析处理系统，构成了相对定量或者绝对定量分析模式的PCR仪。对不同加热原理、不同分析方法的PCR仪的测量结果准确性判定及量值溯源工作提出了新的要求。

1 PCR仪的分类

本文对PCR仪的分类主要参考YY/T 1173-2010《聚合酶链反应分析仪》，并结合实际应用[1]。随着对该类仪器的深入研究及开发利用，控温更精准、检测通量更高、定量分析更准确的PCR仪正逐渐被推广应用，PCR仪的分类也将不断更新完善。

1.1 按控温方式分类

温度控制是PCR仪的关键技术，样品池温度控制的准确性、均匀性和波动性直接影响聚合酶链反应的扩增结果。现阶段PCR仪常见的控温系统有两种。一种是空气循环驱动控温系统，多以电热丝加热，空气制冷，利用风扇将热风或冷风传送给反应孔。也有由热风枪提供热风，冷气由空气或其他制冷设备提供。另一种是半导体铝块基座控温系统（见图1），利用具有热电能量转换特性的特殊导体材料组成串联的PN结（见图2），并通上直流电，便能实现一端制冷一端制热的效果。当电流从N型半导体流向P型半导体方向时，接触处会吸热，形成冷端；当电流从P型半导体流向N型半导体方向时，接触处会放热，形成热端。半导体控温系统已成为PCR仪主流控温系统。

图1 半导体铝块基座控温系统

图2 半导体控温原理

张蓬勃等人依据非稳态传热原理，考虑热量从铝块基座传导至试剂需要一定时间，试剂的升降温相对基座的升降温存在时间延迟，因此，不能直接检测反应池中试剂的实际温度。为解决对试剂温度的实时准确监控，设计了基于红外热像仪的实时温度监控系统[2]。刘超等人设计了PCR微流体芯片温度控制系统，采用具有光学透明的PDMS和ITO导电玻璃，设计制作了温度可控全透明PDMS微流体芯片，实现对PCR反应过程中3个温度区的独立设置和控制[3]。

1.2 按扩增结果处理方式分类

根据PCR仪对扩增结果的处理方式，可将其分为普通PCR仪、实时荧光定量PCR仪和数字PCR仪。

普通PCR仪比实时荧光定量PCR仪少了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，普通PCR仪配合后续检测方法多用于定性地分析是否存在目标片段。

实时荧光定量PCR仪是在扩增时加入荧光染料或者使用带有荧光集团和淬灭集团标记的探针，扩增产生的荧光信号通过采集系统实时传输至分析处理系统，得出量化的实时结果输出。实时荧光定量PCR仪有单通道、双通道和多通道之分，每个通道可以对一种荧光染料进行检测。如果扩增体系采用多个荧光染料标记，则需要多通道的实时荧光定量PCR仪完成多色荧光的同时采集和多个基因的同时检测分析。

数字PCR是一种可以对核酸绝对定量的技术。与荧光定量PCR的区别在于不需要用标准品建立标准曲线，而将一个样本稀释后分配到上万个不同的反应单元中，使每个反应单元不含或包含一个核酸分子，且每个反应单元都会对目标分子进行扩增，然后再对每个反应单元进行荧光信号的统计并计算样本浓度。

2 PCR仪的校准方法分析

2.1 温度校准

JJF 1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》对PCR仪的温度校准包括温度示值误差、温度均匀度、平均升温速率和平均降温速率[4]。上海市计量测试技术研究院的朱晨彬等人提出应对该类仪器进行最大超调温度以及平均超调温度的校准[5]。因为PCR仪在提高升降温速率的同时必然产生热惯性，过高的温度影响酶的活性，不利于引物和靶基因模板的结合，过低的温度也可能导致靶基因模板或PCR扩增产物不能完全变性，导致PCR过程失败。

JJF 1527-2015中对温度校准装置的要求为由若干个（通常是15个）精密温度传感器、数据采集分析模块组成，测温范围0～120 ℃，测量不确定度≤0.1 ℃。规范中未对被校PCR仪的温度指标进行限定，但校准时应根据被校准PCR仪说明书中温度最大允许误差选取测量不确定度≤0.1 ℃，且最大允许误差小于等于被校仪器最大允许误差的三分之一的校准装置。

常用的PCR仪温度控制准确度有±0.1 ℃、±0.15 ℃、±0.2 ℃、±0.3 ℃等，所以PCR仪温度校准装置的温度测量准确度应该在±（0.03～0.1） ℃范围内，国内多数厂家的PCR仪温度校准装置准确度在±（0.01～0.1）℃范围内，满足了JJF 1821-2020《聚合酶链反应分析仪温度校准装置校准规范》中对该类校准装置温度示值最大允许误差±0.20 ℃的要求[6]。

在温度校准过程中，为准确反映PCR反应体系温度，减小测量方法及校准装置带来的测量误差，曾颖研制了厚1 mm、热触点面积1 mm2的薄膜铂电阻测温传感器，并分别测试了PCR仪反应孔座孔壁温度和反应池内温度，如图3所示。测量反应池内部的温度偏差和温度均匀度更好，但该方法因用户所用反应板的个体差异以及导热油的注入量不同而产生测量误差[7]。余松林等人提出一种热敏电阻封装方法，研制出基于热敏电阻传感阵列的PCR仪温度校准系统。该系统使用高灵敏度的热敏电阻进行封装设计，力求紧密贴合PCR仪基座插孔（如图4所示），很好地解决了测量反应池内部温度偏差和均匀度的问题，由于仍采用有线连接控制器的方法，且PCR仪有热盖，多次操作之后会减少传输数据线的寿命，并容易发生缠绕[8]。吕茂超等人利用无线温度传感器和无线手持机研制了一款基于无线网络的PCR仪温度校准装置，实现了温度传感器与采集电路分离，避免了校准时温度对电路的影响[9]。

图3 测温位置

图4 热敏电阻封装

2.2 荧光检测系统校准

荧光检测系统是PCR仪实现定量功能的基础，原理如图5所示。JJF 1527-2015中对荧光检测系统的校准是通过样本示值误差和样本线性的校准实现的。在使用质粒DNA标准物质或者核糖核酸标准物质进行校准时，需要精确配制至少5个梯度的未知样溶液，这必然会引入人为操作误差和稀释误差，影响检测结果的准确性和重复性，当出现异常系统误差时很难分析原因，所以，计量技术机构增加了校准项目，更全面地评价荧光定量检测系统。

图5 荧光检测系统

地方规范JJF（苏）222-2019《实时荧光定量PCR仪校准规范》、JJF（津）04-2020《实时荧光定量PCR仪校准规范》和《数字PCR仪校准规范（征求意见稿）》都提出了对荧光定量检测系统物理项目和生物化学项目的校准，其中JJF（苏）222-2019和JJF（津）04-2020中提到的物理项目包括Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度、通道峰值高度一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移、熔解温度比等，生物化学项目包括荧光强度精密度、样本精密度、荧光线性相关系数、样本线性相关系数等。《数字PCR仪校准规范（征求意见稿）》中建议对拷贝数浓度相对示值误差、拷贝数浓度重复性、荧光通道一致性、荧光强度重复性、反应单元数重复性等项目进行校准[10-11]。

JJF（苏）222-2019和JJF（津）04-2020中还提出以一种PCR扩增光学模拟器实现对光学系统和温度系统的同时校准，PCR扩增光学模拟器集成了高准确度温度传感器和发射光发生器两部分，其控制电路可根据温度传感器监测的温度循环变化驱动发射光发生器发射逐渐增大的光强度，模拟仪器扩增过程。

对于生物化学项目的校准，JJF（苏）222-2019、JJF（津）04-2020和《数字PCR仪校准规范（征求意见稿）》中都采用了与JJF 1527-2015中同样的有证标准物质，但数字PCR仪校准规范对于该类标准物质的拷贝数及不确定度要求做了修改，由拷贝数≥109 copies/μL,相对扩展不确定度≤5%修改为拷贝数≥104 copies/μL，相对扩展不确定度 ≤6%。因 此，GBW（E）091100～ GBW（E）091108系列定量PCR仪校准用标准物质符合规范要求。但对于荧光强度、精密度和荧光线性相关系数校准使用的标准荧光染料的计量特性未做具体要求。

使用标准物质的校准方法虽对PCR仪整机进行了评价，但其操作过程受多种因素影响，如使用的荧光试剂、PCR反应体系、人工操作（试剂稀释）等都给测量结果引入一定的误差。其次，由于定量PCR仪校准用质粒DNA含量标准物质需储存在-20 ℃环境条件下，且运输过程需保证标准物质处于冰冻状态，给现场校准带来一定难度，所以，对PCR仪荧光检测系统的校准逐渐由生物化学方法转向物理光学方法。

3 结语

现阶段PCR仪温度溯源得到了较好的解决，因为温度校准装置便于携带且自动化程度高，人为操作影响小，校准结果的不确定度来源可控，所以多数校准机构对PCR仪只做温度校准项目。为全面评价PCR仪的计量特性，对PCR仪光学检测系统的校准也非常必要，但限于现有的定量PCR仪校准用有证标准物质（包括质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质）的种类较少，生产能力有限，且运输携带不便，以及在使用标准物质过程中需要加入配套的PCR反应体系、人工稀释标准溶液，因此，要求校准机构的工作人员有熟练的实验操作技能。在JJF（苏）222-2019和JJF（津）04-2020中虽提到以一种光学模拟器来模拟PCR过程，将生物化学校准方法一定程度上转向了物理光学方法，具有较强的科学性，但暂时未得到广泛应用。对于数字PCR仪校准规范征求意见稿中提到的荧光强度、精密度、荧光线性相关系数校准所使用的荧光染料，暂时没有相应的有证标准物质，校准的溯源性有待商榷。所以，计量技术人员还应继续在校准装置和校准技术上不断深耕，为PCR仪测量结果的溯源提供持续的技术保证。