免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

李 建，张 敏，薛 霜，张飞雁，朱 薇，石宝兰，漆世华，李文静，王碧群，秦红刚，韩 兴，郑良益，徐 松，舒银辉，冯 钊，李婷婷，谢红玲

(国药集团动物保健股份有限公司，武汉 430075)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员，包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。PCV1为非致病性病毒；PCV3于2016年首次报道，其致病力、流行病学研究、分子生物学研究等刚处于初步研究阶段[1]；PCV2对猪有致病性，是猪圆环病毒病的主要病原，给养猪业造成严重经济损失[2]。

目前，接种疫苗是防控猪圆环病毒病的主要方法。猪圆环疫苗生产企业众多，疫苗质量参差不齐，因猪圆环病毒病对养殖业造成重大经济损失[3]，疫苗质量在出厂前十分重要。不同生产企业评判圆环疫苗质量标准不同，免疫动物后抗体水平检测作为评价疫苗质量的重要指标。由于非洲猪瘟疫情给养殖业带来的重大影响，实验猪来源受限以及经济方面考量，许多生产企业将圆环疫苗免疫小鼠后的抗体水平作为评价疫苗出厂前的质量标准之一。本研究建立了检测小鼠血清中PCV2抗体的ELISA方法，并研制出了ELISA检测试剂盒，可用于小鼠血清中PCV2抗体水平检测和PCV2疫苗质量评价。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 重组杆状病毒CP08株由国药集团动物保健股份有限公司研发中心实验室构建，HRP标记羊抗小鼠IgG(Sigma公司)，新西兰大白兔(购自湖北省疾病预防控制中心)，超速离心机(Beckman)等。

1.2 PCV2 Cap蛋白的表达与纯化 将重组杆状病毒CP08株按照0.5 MOI接种到Sf9细胞中，27 ℃培养72～96 h，收获细胞培养物，经CsCl密度离心[4]纯化后进行SDS-PAGE电泳和电镜分析。

1.3 PCV2 Cap蛋白兔多抗的制备 PCV2 Cap蛋白常规免疫健康家兔[5]，待兔血清中PCV2抗体 ELISA检测效价达1∶1000，即可采血分离血清。分离的血清通过辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化，获得所需抗 PCV2 Cap蛋白纯化多抗。

1.4 试剂盒的研制

1.4.1 反应条件的确定 纯化的PCV2 Cap蛋白兔多抗经系列稀释包被酶标板，结合不同稀释浓度的PCV2 Cap蛋白，按照方阵滴定方法[6]确定PCV2 Cap蛋白兔多抗和PCV2 Cap蛋白最佳包被浓度。对ELISA封闭液、酶标二抗稀释度、底物显色液及终止液进行优化[7]。

1.4.2 试剂盒的组装 根据1.4.1中优化后的反应条件组装试剂盒，该试剂盒由96孔抗原检测板、阳性和阴性对照血清、羊抗小鼠IgG酶标二抗、显色液A和B、终止液和10倍浓缩洗涤液组成。

1.4.3 判定标准的确定 选用间接免疫荧光试验(IFA)检测血清抗体阴性小鼠血清50份，用组装的试剂盒进行检测并对检测结果进行统计学分析，计算阴阳性值的临界点。

1.4.4 敏感性、特异性和比较试验 选取6份不同的PCV2抗体阳性小鼠血清，进行倍比稀释，检测所制备试剂盒的敏感性；分别对阴性小鼠血清、PRRSV、CSFV、PEDV及PRV阳性小鼠血清进行检测，判断试剂盒的特异性；取100份小鼠血清样本用本研究试剂盒和IFA方法分别进行检测，分析符合率。

1.4.5 试剂盒重复性和保存期试验 取3个不同批次的试剂盒，每批5个，分别检测PCV2阳性小鼠血清和阴性小鼠血清，计算批内及批间变异系数(CV)。将试剂盒置2～8 ℃保存，不同时间取样检测保存期。

1.4.6 试剂盒应用效果评估 选取10周龄SPF小鼠50只，用本公司研制的PCV2杆状病毒载体灭活疫苗(CP08株)及三种商品化疫苗(进口PCV2基因工程疫苗和国产全病毒灭活疫苗1及国产全病毒灭活疫苗2)进行常规免疫，每种疫苗免疫10只小鼠，留10只小鼠做空白对照，免疫后28 d采血，用本研究试剂盒对免疫小鼠血清进行ELISA检测。

2 结果与分析

2.1 PCV2 Cap蛋白表达、纯化与鉴定 将表达的PCV2 Cap蛋白经超滤浓缩，氯化铯密度梯度离心纯化，经SDS-PAGE鉴定，在28 kD左右可见条带(图1)；经铜网负染色，电镜下可见大量的病毒样颗粒(图2)。

M： Marker; 1： 样品1; 2： 样品2; 3： 阴性对照

图2 PCV2 Cap蛋白电镜(负染，25000×)

2.2 PCV2 Cap蛋白兔多抗制备 PCV2 Cap蛋白经3次免疫新西兰大白兔，血清PCV2 Cap蛋白抗体效价达1∶4000，分离血清经辛酸硫酸铵纯化，电泳结果见图3。

M： Marker; 1： 纯化PCV2 Cap蛋白兔多抗

2.3 试剂盒研制

2.3.1 反应条件的确定 确定PCV2 Cap蛋白兔多抗最佳包被浓度为4 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜，封闭液1% BSA，每孔200 μL，37 ℃封闭2 h后包被抗原，PCV2 Cap蛋白抗原最佳包被浓度为2 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜，一抗1∶100稀释，每孔100 μL，37 ℃反应60 min，二抗最佳稀释度为1∶2000，每孔100 μL，37 ℃反应60 min，显色液A和B每孔各50 μL，显色10 min，2 mol/L的硫酸终止，酶标仪OD450 nm读数。

2.3.2 判定标准的确定 使用本试剂盒检测经IFA检测抗体阴性健康小鼠血清50份，求其平均 OD450nm值0.152；标准差=0.061；按临界值=阴性样品平均值+3×标准差计算，其临界值为0.335。所以待检血清OD450nm值≥0.335判为阳性，待检血清OD450nm值<0.274判为阴性。在0.274≤OD450nm<0.335范围内，为可疑，需进行第二次检测，如还在此区间判为阴性。

2.3.3 敏感性、特异性和比较试验结果 6份阳性小鼠血清ELISA检测结果均为阳性， ELISA检测最高稀释倍数 (ELISA效价) 可达1∶16000，结果见表1；试剂盒对阴性小鼠血清和4份猪其他病毒抗体阳性小鼠血清(PRRSV、CSFV、PEDV、PRV)的ELISA检测结果均为阴性，特异性良好；100份小鼠血清样本的检测结果显示，本研究试剂盒和IFA方法的总符合率为96%(96/100)，结果见表2。

表1 试剂盒检测小鼠血清结果

表2 ELISA试剂盒与IFA检测方法符合率

2.3.4 重复性和保存期试验 取3个不同批次的试剂盒，每批5个，分别检测PCV2阳性小鼠血清和阴性小鼠血清，批内变异系数为2.28%～4.17%，批间变异系数为4.27%～6.02%。保存期试验结果表明，2～8 ℃保存15个月稳定。

2.3.5 试剂盒应用效果评估 检测结果显示，不同疫苗免疫28日小鼠血清的PCV2抗体阳性率均在100%，结果见表3。依据免疫小鼠后抗体水平，CP08组抗体水平最高，进口组次之，国产组1抗体水平最低；依据免疫小鼠后各组抗体均匀性，各疫苗免疫组产生抗体一致性良好，国产组1均匀最好，进口组产生抗体均匀性稍差；各免疫组与对照组相比，差异极显著。结果见图4和表3。

****表示P<0.0001，差异极显著

表3 不同疫苗人工免疫小鼠血清效价检测结果

3 讨 论

PCV2抗体检测的常用方法有病毒中和试验(SN)、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)。SN、IFA和IPMA试验均需要结合细胞及病毒培养来进行检测，费时费力，对操作人员要求高，不适合推广和普及[8]。Cap蛋白是 PCV2 病毒的主要结构蛋白，该蛋白成为基因工程疫苗首选抗原，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原[9-10]。

本研究利用兔多抗捕获包被法建立了一种检测小鼠血清PCV2抗体的方法，并组装形成试剂盒。研究结果表明，试剂盒灵敏度和特异性良好，可重复性强，2～8 ℃保存15个月稳定。应用该试剂盒对PCV2疫苗免疫后的小鼠血清进行PCV2抗体检测，检测效果良好。当前，各疫苗生产企业对于猪圆环疫苗产品质量标准评判不同，免疫动物后检测其抗体水平作为其质量标准之一；目前，市场已有商品化检测猪圆环抗体试剂盒在售，均为检测猪血清中圆环抗体；由于非洲猪瘟疫情的影响导致动物来源困难以及经济方面的考量，许多圆环疫苗生产企业将免疫小鼠检测其血清抗体水平作为圆环疫苗质量标准的评判方法。本研究为圆环疫苗生产企业提供一种便捷的检测方法及产品，用以评判免疫小鼠后血清抗体水平，对于圆环疫苗销售前质量检测提供一种参考指标。同时，本研究试剂盒中的二抗替换为抗猪IgG，可用于检测猪血清中猪圆环病毒抗体。本研究制备的检测小鼠血清中猪圆环抗体ELISA试剂盒，可作为疫苗生产企业评判圆环疫苗免疫小鼠后抗体水平的检测产品，为检测小鼠血清PCV2抗体提供一种快速便捷方法，对于当前疫苗生产企业具有重要的经济价值[11]。