基于网络药理学探讨党参、海藻“药对”治疗肝癌的作用机制及关键的靶点通路预测

刘婷婷，李新，杨冰，田成旺，徐旭，李国霞

（1.天津医科大学国际医学院中西医结合教研室，天津 300070；2.天津药物研究院，天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300301）

肝癌是全球第6 大最常见恶性肿瘤，我国是肝癌高发国家，每年全球肝癌新增病例约半数在中国。由于早期不易发现、不典型；晚期高转移、高复发的特点，导致肝癌死亡率极高，肝癌死亡率从2018 年的第3 位上升到2020 年的第2 位，仅次于肺癌[1-2]。尽管传统的肝脏切除术、肝脏移植术、靶向治疗、放射介入和局部消融等新兴治疗手段的出现，使得肝癌的治疗效果不断提高，但肝癌发展迅速使得预后并不理想，因此寻找靶向清晰、高效低毒的新型抗肝癌药物是今后肝癌研究的重要任务。

《诸病源候论》积聚病诸候篇中“诸脏受邪，初未能成积聚，留滞不去，乃成积聚。”认为肝癌的发生是外感六淫邪气，内在机体虚损、情志内伤以及饮食不节等因素引起肝脾功能失调，寒积、痰浊、气滞、血瘀、湿邪热毒等实邪长期积聚形成[3]。同时，正邪交争是癌症发生的关键，人体正气充足时能抵抗邪气的入侵，不会发生癌症，相反则会发生癌变。中医治疗原发性肝癌最常用的治法是“益气软坚”：“益气”即增强自身免疫以抵御外邪，“软坚”即软坚散结消炎，目的是从根本上扶助正气的同时祛除毒邪、消散肿瘤，改善机体邪盛正衰的状态[4]。本次网络药理实验依据中医治疗肝癌法则之“益气软坚”，选用党参作为“益气”之用，海藻发挥“软坚”之功，探讨该“药对”治疗肝癌化学成分及其作用机制。

《本草从新》首载“党参”，属于上等之佳品，味甘、性平，归脾、肺二经，有补中益气、健脾益肺、养血生津之效。现代药理研究证实党参多糖可以抗肿瘤、提高免疫和抗疲劳等[5-6]。海藻始见于《神农本草经》，味苦、咸，性寒，归肝、胃、肾经，有软坚、化痰、利水、消肿的功效[7]。近年来，海藻在治疗各种肿瘤中显示出独特的优势，未来具有不错的发展前景[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品 对照品岩藻甾醇（质量分数≥98%，批号99718），粉末4℃避光保存，购自美国MCE 公司。

1.1.2 细胞株 人HepG2 肝癌细胞，购自武汉普诺赛生物科技有限公司。

1.1.3 试剂 DMEM 细胞培养基（批号8121330）、胎牛血清（批号2279804CP）、0.25%胰蛋白酶（批号2186962）购自美国Gibco 公司；100×青霉素-链霉素溶液（批号C0222）购自碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO，批号D8371）购自索莱宝公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）粉剂（批号MKCL9866）购自美国Sigma 公司。

1.1.4 仪器 Multiskan Go 全自动酶标仪（美国Thermo 公司）；TDL80-2B 型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；CKX-41 型倒置显微镜（日本Olympus公司）；SeriesⅡ型二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；Revco PLUS 型-80℃冰箱（美国Thermo 公司）；超微量移液器（美国Thermo 公司）；超净工作台（上海Heal Force 公司）；细胞计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 获取党参、海藻化学成分 本研究从中药系统药理分析数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）以及“中国知网”中获取党参、海藻化学成分。筛选条件是根据TCMSP 数据库中药物动力学（absorption and distribution andmetabolismand excretion，ADME）参数而定，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性指数（DL）≥0.18 为条件，筛选符合的化学成分。由于TCMSP 中收录的化学成分有局限性，另外采用文献挖掘的方法从“中国知网”中补充收集党参、海藻“药对”的化学成分。

1.2.2 获得党参、海藻化学成分的潜在作用靶点（1）从TCMSP 数据库得到活性成分的部分靶点。（2）从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到活性成分的Canonical SMILES，将其输入SEA数据库（http://sea.bkslab.org/）获得活性成分的部分靶点。（3）从《中药活性成分分析手册》中查到党参、海藻化学成分的结构，导入Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）获得部分靶点。去掉重复靶点，得到最终靶点。

1.2.3 检索肝癌的作用靶点 从TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）或OMIM数据库（http://www.omim.org/）中搜集与肝癌相关的靶点，输入“Liver cancer”、“Human hepatocellular carcinoma”等关键词汇进行搜索，取得分≥0.4 的靶点。将挖掘得到的肝癌相关基因与党参、海藻“药对”靶点基因互相映射，获得党参、海藻“药对”治疗肝癌的作用靶点。

1.2.4 构建党参、海藻-化合物-靶点-肝癌网络 使用Cytoscape3.8.2 软件来构建党参、海藻-化合物-靶点-肝癌的可视化网络，预测化合物和靶点之间的关系。网络中的节点（node）表示党参、海藻、肝癌、化合物以及靶点，以边（edge）表示药物化合物与靶点之间的联系，靶点是肝癌与活性成分共有的靶点。

1.2.5 党参、海藻“药对”与肝癌作用靶点PPI 网络构建 将关键靶点在STRING 在线分析平台（https://string-db.org/）构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，最低相互作用评分设为“medium confidence”（＞0.4），选择隐藏游离节点，其他保持默认值，限定研究物种为“Homo sapiens”，最后Cytoscape3.8.2 软件以度值为标准构建蛋白互作网络。

1.2.6 GO 生物功能、KEGG 通路富集分析 运用OmicsBean 数据库（http://www.omicsbean.cn/）获得32 个靶点蛋白的基因本体（GO）功能及基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，GO 富集分析的结果有3 大类，分别为“蓝色”生物过程（BP）、“红色”细胞化合物（CC）和“黄色”分子功能（MF）。以P＜0.05 为限定条件，从基因生物功能与信号通路角度进一步明确党参、海藻”药对”对治疗肝癌的作用机制。

1.2.7 细胞培养 人HepG2 肝癌细胞培养于DMEM 完全培养基，5%CO2、饱和湿度的37℃恒温培养箱中生长。生长至对数生长期且状态良好时，用胰蛋白酶消化传代，进行后续实验。

1.2.8 MTT 法检测岩藻甾醇对人HepG2 肝癌细胞增殖的影响 96 孔板中每孔接种100 μL HepG2细胞悬液，继续生长至约40%时加入不同浓度的岩藻甾醇溶液（0、0.06、0.12、0.24 mmol/L），每组设6 个复孔，处理24 h，每孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h，DMSO 振荡摇匀10 min，测490 nm 处的吸光度（A490 值），重复3 次。计算各组岩藻甾醇溶液对HepG2 细胞的抑制率：（1-A给药组/A空白对照组）×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0 软件实现数据的统计分析，计数资料用n（%）表示，组间比较采用χ2检验，计量资料进行正态性检验，符合正态分布的数据用±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 获取党参、海藻化学成分 从TCMSP、中国知网中获得党参、海藻化合物成分29 种，剔除3 个未查询到靶点的化合物，剩余26 种活性化合物，其中党参20 种、海藻6 种，未有重复成分，化合物信息见表1。

表1 党参20 种、海藻6 种化学成分基本信息Tab 1 Basic information of chemical constituents of 20 species of Codonopsispilosula and 6 species of Sargassum

2.2 获得党参、海藻化学成分的潜在作用靶点 通过TCMSP、SEA、Swiss Target Prediction 数据库检索29 种活性化合物潜在的相关靶点，收集到靶点党参有978 个，海藻有839 个，去除重复后得到靶点964 个。

2.3 检索肝癌的作用靶点 通过TTD、OMIM 数据库，共获得与肝癌相关的486 个靶点。党参、海藻“药对”治疗肝癌的共同潜在作用靶点有32 个，见表2。

表2 党参、海藻“药对”治疗肝癌的32 个共同潜在作用靶点Tab 2 32 common potential targets of "drug pair" of Codonopsispilosula and Sargassum in the treatment of liver cancer

2.4 构建党参、海藻-化合物-靶点-肝癌网络 对党参、海藻“药对”含有的化合物、化合物靶点以及肝癌靶点、肝癌进行关联，利用软件Cytoscape3.8.2 构建网络图，图1 为得到的网络图（红色为共同靶点，蓝色为化合物，绿色为海藻，黄色为党参，紫色为疾病肝癌）。图中有26 种化合物节点，32 个靶点节点，2 个药物节点，1 个疾病节点。在网络图中一个节点连接线的数目称为度，度的高低代表节点在网络中的重要程度。

图1 党参、海藻-化合物-靶点-肝癌网络图Fig 1 Codonopsispilosula，Sargassum -compound-target-liver cancer network map

2.5 靶点PPI 网络、关键基因分析 将32 个党参、海藻“药对”与肝癌共同靶点输入STRING 数据库，获得PPI 网络，隐藏3 个游离节点之后PPI 网络包含29个靶基因节点，共有199 条相互作用连线（图2）。之后导入Cytoscape3.8.2 软件，获得各个蛋白的度值大小，PPI 网络代表各个蛋白与其他蛋白相互作用，度值越大表示该蛋白在该网络中发挥的作用越大，先根据度值筛选出前10 位，见表3。其中细胞表皮生长因子受体（EGFR）、蛋白激酶B（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）与TP53 是表3 中度值最大的前4 位，预测可靠性更高、结构更精准，因此选择前4位靶点作为本次网络药理筛选出的关键靶点。

表3 蛋白度值表（按由大到小筛选出前10 位）Tab 3 Proteinvaluetable（thetop10arescreenedfromlargetosmall）

图2 蛋白互作网络图Fig 2 Protein interaction network diagram

2.6 GO 集分析和KEGG 分析党参、海藻“药对”的32 个共同潜在靶点在信号通路中的作用 筛选BP、CC 和MF 的前10 个富集条件作图，其中BP（生物学过程）涉及细胞增殖、程序性死亡调节、凋亡过程负调控和催化调节等多个生物过程，基因占比均＞50%；CC（细胞化合物）涉及胞质、细胞器以及细胞核等细胞结构，胞质占比最高，除膜筏、核染色区占比较低之外，其他基因占比均在40%以上；MF（分子功能）涉及最关键的是蛋白质二聚活性，基因占比约90%左右（图3、表4）。此外党参、海藻“药对”治疗肝癌的KEGG 分析，根据P 值和分数筛选出前10 条KEGG 通路（P＜0.05），其中信号通路包括癌症通路、MAPK 信号通路、PI3K-AKT 信号通路和Ras信号通路等，疾病通路有乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌、结直肠癌等，其中MAPK 和PI3K-AKT 是最关键的两条通路（表5、图4），图4 中P 值越小，圆圈越大，关联度越大，颜色越深。

图4 党参、海藻“药对”治疗肝癌KEGG 通路富集分析气泡图Fig 4 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of Codonopsispilosula and Sargassum"drug pair"in the treatment of hepatocellular carcinoma

表4 党参、海藻“药对”治疗肝癌潜在靶点GO 富集结果(各前10 条)Tab 4 GO enrichment results of potential targets of Codonopsispilosula and Sargassum"drug pairs"in the treatment of liver cancer(top 10 each)

表5 党参、海藻“药对”治疗肝癌潜在靶点KEGG 富集分析（前10 条）Tab 5 KEGG enrichment analysis of potential targets of Codonopsispilosula and Sargassum "drug pair" in the treatment of hepatocellular carcinoma（Top 10）

图3 党参、海藻“药对”治疗肝癌的潜在靶点GO 富集分析柱状图Fig 3 Histogram of GO enrichment analysis of potential targets of"drug pair"of Codonopsispilosula and Sargassum in the treatment of liver cancer

2.7 岩藻甾醇对人HepG2 肝癌细胞增殖的影响如表6 所示，与空白对照组（0 mmol/L）相比，岩藻甾醇各剂量组细胞存活率明显降低，差异均有显著性（均P＜0.05）。

表6 岩藻甾醇对人HepG2 肝癌细胞增殖抑制率的影响（±s，n=6）Tab 6 Effect of fucosterol on proliferation inhibition rate of human HepG2 hepatoma cells（±s，n=6）

表6 岩藻甾醇对人HepG2 肝癌细胞增殖抑制率的影响（±s，n=6）Tab 6 Effect of fucosterol on proliferation inhibition rate of human HepG2 hepatoma cells（±s，n=6）

注：与空白对照组相比，*P<0.05

组别 细胞增殖抑制率（%）空白对照组 0 15.10±3.10*岩藻甾醇组 26.46±2.45*31.22±1.67*浓度（mmol/L）0 0.06 0.12 0.24 OD 值(A490 nm)0.368±0.009 0.312±0.011 0.270±0.011 0.253±0.018

3 讨论

党参、海藻“药对”抗肝癌网络药理实验获得4 种有后续研究意义的化合物，依次为木犀草素、党参炔苷、槲皮素、岩藻甾醇。木犀草素与槲皮素是大多数中药普遍含有的活性化学物质，目前已有许多文献报道其有抗肿瘤作用，对于肝癌也有不错的治疗效果。党参炔苷是党参的主要代表成分，海藻多糖由于种类繁多且结构非常复杂，TCMSP 数据库并未收入，因此岩藻甾醇作为海藻主要代表成分，目前还未有文献报道显示党参炔苷与岩藻甾醇可以抗肝癌，本次网络药理预测结果显示党参炔苷与岩藻甾醇对于肝癌的治疗有一定的作用；EGFR、AKT1、VEGFA与TP53 等为主要作用靶点；MAPK 和PI3K-AKT等为最主要的信号通路。

木犀草素（Luteolin）是一种天然黄酮类化合物，主要存在于十字花科、天南星科、伞形科等药物和蔬菜中，有抗肝癌作用[9]。槲皮素（Quercetin）广泛存在于各种食品中，功效有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等[10]，据报道显示槲皮素可以抑制人肝癌HepG2 细胞增殖和迁移[11]。岩藻甾醇（Fucosterol）是从褐藻中提取的一种成分，研究表明岩藻甾醇可诱导卵巢癌细胞分化、抑制细胞增殖[12]，目前尚未有抗肝癌的报道。党参炔苷（Lobetyolin）是一种聚乙炔糖苷，在党参属植物中含量较高，实验证明党参炔苷呈剂量依赖性（10～40 μmol/L）抑制体外培养的HCT116 结肠癌细胞的增殖，并诱导caspase 依赖性的凋亡[13]，目前党参炔苷尚未有抗肝癌的报道。

EGFR 是一种酪氨酸激酶，其过表达与肿瘤发生、发展密切相关，可作用于下游相关信号通路来调节肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[14]。AKT1 是PI3K/AKT 信号通路重要的下游靶标[15]。AKT1 可通过抑制细胞凋亡而促使细胞存活，AKT1 被磷酸化激活预示着肝癌细胞有侵袭性[16]。VEGFR 参与血管相关细胞的分裂、增殖和迁移，肿瘤血管的形成是诱发肿瘤侵袭和转移的必要步骤[17]。TP53 是一种抑癌基因，若该基因发生突变将会促进肿瘤发展，同时细胞分化、细胞凋亡、血管生成和抑制转移等也会随之相应改变[18]。目前槲皮素、木犀草素均被发现可抑制人肝癌细胞中AKT1 蛋白的磷酸化激活，诱导细胞凋亡[19-20]。研究显示[21-22]，槲皮素、木犀草素可激活P53 信号通路中TP53 抑癌基因，造成胰腺癌、肝癌和结肠癌肿瘤细胞凋亡。岩藻甾醇与党参炔苷未有相关研究证实是通过以上分子发挥作用，今后还需不断探索。

MAPK 信号通路包括ERKs、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK 介导通路[23]。研究证明ERKs、JNK 和p38MAPK 信号通路都能引起HepG2 细胞G2/M 周期阻滞，从而起到抗肝癌细胞增殖的效果[24]。PI3K/AKT 信号通路对细胞凋亡发挥着重要调控作用[25]。诸多研究将PI3K/AKT 信号通路作为治疗慢性肝病的重要靶标[26]。孙佳等[27]证明槲皮素能下调肝癌细胞PI3K/AKT 通路，增强凋亡因子、降低抗凋亡蛋白的活性，从而促使肝癌细胞凋亡，发挥抗肝癌的作用。

综上所述，党参、海藻治疗肝癌是多成分、多靶点、多生物过程而实现的，体现了中医药治病的整体理念，为后续相关研究提供实验依据。本实验通过MTT 法初步验证岩藻甾醇可以抑制HepG2 肝癌细胞增殖，且与浓度呈正相关。后期将以上述实验结果为基础，继续通过细胞和动物实验深入研究，为党参、海藻药对抗肝癌提供扎实有力的实验依据。