PI3K/AKT信号通路调控骨关节疾病软骨细胞自噬及损伤的机制

邓 欢，吕艺蓁，刘 宣，肖 香，乔利春，郭紫薇，赵 妍，刘家欣，韩 晶

（西安交通大学医学部公共卫生学院，陕西西安 710061）

大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)是一种儿童发育中以四肢关节透明软骨变性、坏死以及继发性骨关节病为主要病变特征的地方性、多发性、慢性变形性骨关节病。情况严重时，还会引发化骨障碍和干骺早闭，导致骨骼发育不良和畸形，或出现患者身材矮小，同时可能继发骨关节炎(osteoarthritis,OA)和晚期残疾[1]。OA是一种全球性的十分常见的骨关节疾病，以关节疼痛和肿胀反复发作并加重、活动受限和畸形为主要临床症状。这两种骨关节疾病都严重影响了患者的生活质量和身心健康，给家庭和社会带来一定的经济负担。近年来，大量研究从疾病相关蛋白的表达水平对KBD、OA等骨关节疾病的发病机制进行了深入探索。现有研究发现，PI3K/AKT信号通路对KBD及OA的发生和发展有重要作用[2]，且该通路与骨关节疾病患者关节软骨细胞自噬和损伤密切相关。因此，以下对PI3K/AKT信号通路调控KBD及OA软骨细胞自噬和损伤及机制的研究现状进行综述，为进一步探索KBD及OA的发病机制和治疗方案提供科学依据。

1 骨关节疾病软骨细胞中的自噬

细胞自噬的概念于1963年由著名细胞生物学家Christian De Duve首先提出，是一种通过降解细胞成分以响应营养限制的过程[3]。在此过程中，溶酶体参与水解细胞质内容物从而产生营养和能量，以维持基本的细胞活动。自噬作为重要的细胞应激反应机制，在维持细胞稳态中起着至关重要的作用，在正常生理状态时处于低水平状态；而在应激情况如营养缺乏、生长因子缺乏、缺氧等条件下，可促进细胞自噬上调，使得细胞内大分子或细胞器降解成可循环利用的细胞成分[4]。另外，在某些条件下，自噬与细胞死亡也相关[5]。

广泛研究表明，磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是一种能够通过调节细胞代谢以维持能量平衡的能量感受器，可促进自噬。相反，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种能够整合生长因子和营养信号的细胞生长调节剂，能够抑制自噬[6]。自噬是一个严格调控的过程，自噬缺陷与许多人类疾病密切相关，保持自噬程度的稳定不仅是软骨细胞重要的生存条件，还可预防或延缓软骨退行性改变。

骨关节疾病中软骨细胞的自噬、损伤与坏死关系密切。自噬本身作为一种保护机制，在软骨细胞受到不利刺激的初期，有助于对抗和延缓细胞损伤的进程；当损伤性刺激持续存在或不断加重，软骨细胞的自噬能力出现障碍或缺陷，不足以清除细胞累积的大分子和受损细胞器，呈现自噬活性降低状态，细胞稳态被打破，代谢失衡，直至细胞坏死，即软骨细胞损伤包含了软骨细胞坏死。

2 PI3K/AKT信号通路对软骨细胞自噬的调控作用

2.1 PI3K/AKT信号通路的组成及功能

PI3K/AKT是重要的细胞内信号转导途径。近年来因其参与调控软骨细胞增殖、分化、存活等，作为KBD和OA发病的核心通路而备受关注[2]。3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)是一种由一个催化亚基和一个调节亚基组成的异源二聚体蛋白，共有3种同工酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型被认为与关节软骨损伤的发生进展关系密切而备受研究者关注[7]。Ⅰ型PI3K的亚型PI3Kγ和PI3Kδ可促进巨噬细胞激活，从而调控滑膜炎、介导软骨损伤过程[8]。Ⅰ型PI3K的催化亚基在哺乳动物细胞中又分为ⅠA亚型和ⅠB亚型。其中ⅠA亚型由催化亚基p110和调节亚基p85组成，p85亚基在生理状态下抑制PI3K的表达。PI3K的激活主要分为两种途径，一种是通过生长因子受体信号通路激活，即酪氨酸残基发生磷酸化，与p85亚基的src同源序列2相互作用引起p110亚基构象调节，导致PI3K二聚体自身发生变构而被激活；另一种是通过p110亚基直接结合Ras而被激活[9]。被激活后的PI3K进一步向下游传导刺激，其p110亚基通过作用于细胞膜上的4,5-双磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)的第三位羟基位点，催化并磷酸化该位点后转化为第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)，为具有PH结构域的脂类蛋白激酶结合到细胞膜上提供必要的结合位点。

PI3K下游靶蛋白AKT位于细胞中，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，也被称为蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，共有3种亚型AKT 1、AKT 2、AKT 3，其中AKT 1与AKT 2参与骨细胞合成和代谢的平衡调节。AKT和PI3K由于兼具PH结构域，二者均可在PIP3的介导下由细胞内迁移结合到细胞膜上，转位后的AKT可发生变构使其T-Loop区的催化位点得以暴露。膜上的PDK 1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase,也称PDK或PKBK)通过协同催化PIP3与AKT的PH结构域结合，激活AKT，也可通过PDK2使AKT被完全激活[10]。

2.2 PI3K/AKT信号通路对软骨细胞的作用

PI3K/AKT信号通路具有促进软骨细胞增殖和抑制自噬的作用。激活的AKT可以通过磷酸化作用于多种相关下游靶分子如Bad、NF-κB、mTOR和Caspase-3等调节软骨细胞存活、自噬与凋亡，介导软骨组织损伤过程[11-12]。抑制PI3K/AKT信号通路的活性将阻碍软骨细胞中蛋白多糖的合成，并降低软骨细胞存活率[13]。此外，AKT的活化抑制是IL-β诱导软骨细胞发生自噬的重要机制，AKT抑制剂能够明显阻断某些药物（如人参皂苷、紫草醌等）对软骨细胞自噬的效应作用[14]。ULICIETAL[15]在培养成长期鼠胫骨软骨细胞过程中加入PI3K抑制剂，发现阻断PI3K/AKT信号转导途径后发生自噬的软骨细胞增多。

2.3 PI3K/AKT信号通路和m TOR共同调控细胞自噬

细胞自噬活性受mTOR的抑制。mTOR包含两种不同形式的复合物mTORC1和mTORC2，其中mTORC1在自噬中的负调控功能已被证实，且AMPK对细胞自噬的促进作用也通常被认为是通过在TSC2和Raptor水平上抑制mTORC1而间接实现[16]。例如，在葡萄糖饥饿的诱导作用下，mTORC1上游通路激活AMPK，进而磷酸化结节性硬化症复合物2（tuberous sclerosis complex 2,TSC2），抑制mTORC1的活性，使mTORC1间接失去对下游ULK自噬起始复合物的自噬抑制位点的控制，细胞的自噬活性上调。另外，mTORC2与细胞骨架的重组与细胞的存活有关，其磷酸化可激活AKT，进而抑制细胞自噬的发生[17]。

研究表明，PI3K/AKT与mTOR可构成PI3K/AKT/mTOR信号通路并参与到多种生物调节过程中，调节细胞生长、分化和代谢。其中AKT承接上游PI3K信号，并将信号传递给AKT下游靶点mTOR，起到“承上启下”的作用。PI3K通过生长因子受体信号通路激活，作用并磷酸化AKT，AKT作用于TSC1/2复合物抑制其活性，使得mTORC1被激活，进而磷酸化下游的ULK1自噬起始复合物的自噬抑制位点，抑制细胞自噬[18]（图1）。

图1 PI3K/AKT/mTOR信号通路示意图Fig.1 Schematic diagram of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

3 KBD和OA中PI3K/AKT通路调控软骨细胞自噬的机制

3.1 KBD和OA软骨细胞损伤和自噬的表现

近年来已发现在KBD和OA这两种疾病中有一些相似的病理改变，包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解、软骨退变等[19]。OA典型的病理表现为关节软骨的退行性改变、增生及骨赘形成，关节软骨和骺板软骨等软骨组织损伤和坏死等[20-21]。

相比于OA，KBD的特征性病理改变主要是深层软骨细胞的坏死，坏死可蔓延至中层、表层。超微结构改变主要表现为软骨细胞膜质膜节段性缺损；线粒体肿胀，嵴断裂、溶解，部分线粒体空泡化；内质网呈现池样扩张，核膜节段性缺损；胞质内出现髓样小体和变性空泡。软骨细胞边缘基质疏松，胶原纤维变少，最终崩解[22]。KBD软骨细胞出现损伤时，其软骨表现出与OA相似的临床特征和病理改变，如ECM降解、软骨变性和软骨细胞凋亡。

研究表明，当KBD和OA软骨细胞自噬缺陷时，表现出细胞核、线粒体、糖原沉积和微丝等多种异常；细胞严重变形，细胞核明显扭曲，线粒体肿胀，细胞质中存在大量的溶酶体；由于细胞坏死和破坏，在软骨中可观察到空腔[23]。此外，KBD还伴有不同软骨损伤表现，包括细胞过度去分化、生长板和关节软骨的局灶性细胞坏死，以及软骨细胞表型、线粒体功能、基因和蛋白表达谱的改变[24-31]。

3.2 KBD和OA软骨细胞中PI3K/AKT通路与自噬的研究

目前，针对PI3K/AKT信号通路异常和软骨细胞自噬进行的骨关节疾病的研究主要集中于OA，PI3K/AKT信号通路在OA中的研究已经相当广泛[32]。有证据表明，自噬在OA软骨中具有保护和促进软骨细胞存活的功能，而自噬的丧失或紊乱被认为是导致OA的一种机制[33]。

在OA发病过程中，从宏观来讲，关节软骨处于退变的发展过程，早期机体软骨细胞自噬水平增强，保护软骨细胞免受代谢异常、炎症刺激或氧化应激等因素的损害；随着病情进展，软骨细胞中受损的细胞器和大分子逐渐积累，软骨细胞抗氧化能力和自噬水平下降，导致软骨组织修复能力降低。从微观来看，OA早期，PI3K/AKT信号通路相关蛋白的正常表达受到了抑制，软骨细胞的自噬活性升高，一定程度上发挥了延缓软骨退变、抑制炎症反应的作用。但随着衰老或内外环境持续刺激，受损细胞器在软骨细胞中累积，PI3K/AKT信号通路水平升高，自噬活性受到抑制，软骨细胞降解增加，炎症和细胞死亡增加，导致OA。因此，在OA疾病不同阶段，软骨细胞的损伤、自噬水平和PI3K/AKT信号通路的活性有着不同表现，具体为早期PI3K/AKT通路活性受到抑制，软骨细胞自噬增强，到中晚期PI3K/AKT通路上调，软骨细胞自噬受到抑制。

然而，目前以KBD软骨细胞作为研究对象的自噬相关研究相对较少，直接从PI3K/AKT信号通路角度进行KBD软骨细胞自噬的研究更少。对KBD人群全血进行检测，结果显示，相比于正常人群，KBD患者全血中PI3K/AKT信号通路分子蛋白PI3Kp110、pAKT、pGSK 3β表达明显增加，PI3K/AKT信号通路呈激活状态[34]。在关于一种硒蛋白SEPS1的基因多态性与PI3K/AKT信号通路的研究中，发现这种硒蛋白的基因多态性能够影响KBD的PI3K/AKT信号通路的表达，并与KBD的疾病风险有一定关联性[35]。还有研究提出，KBD患者和氧化损伤软骨细胞中PI3K/AKT通路上调[36]，KBD软骨细胞中存在自噬缺陷，但缺陷的程度轻于OA[23]。

随后，整合基因组DNA甲基化和mRNA表达谱的研究同样表明，PI3K/AKT信号通路在KBD与OA软骨中显示出不同的基因表达水平和DNA甲基化水平[37]。与正常人群对比，发现KBD软骨细胞中自噬易感基因ATG4表达降低，进一步佐证了KBD的软骨细胞存在自噬功能障碍[38]。

3.3 PI3K/AKT通路调控软骨细胞自噬的机制

有研究证实，激活PI3K/AKT信号通路促进软骨中胶原降解基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)的表达，导致软骨细胞的肥大分化显著提前，促进前成骨细胞和间充质干细胞的分化。特异性阻断PI3K/AKT信号通路可影响骨细胞增殖，引起骨质流失等[39]。PI3K/AKT信号通路表达的下调可抑制软骨细胞增殖，引起软骨组织肥大细胞分化延迟、促进软骨细胞凋亡等软骨损伤性改变[40]。

在OA大鼠模型中，大鼠软骨PI3K/AKT/mTOR自噬通路上调，自噬相关蛋白ATG5、ATG7、Beclin-1出现下调，自噬受到抑制，这一过程可能参与OA软骨病变过程[41-42]。将PI3K/AKT通路抑制剂芍药苷直接作用于人软骨细胞C28/I2的炎症复制模型，增强了软骨细胞自噬能力，减少炎症因子生成，从而达到治疗OA炎症反应的效果[43]。使用PI3K/AKTmTOR信号通路抑制剂盐酸青藤碱注射液注射于兔OA模型膝关节腔关节软骨，观察到关节软骨自噬水平上调[44]。因此，PI3K/AKT/mTOR通路下调软骨细胞自噬活性，引起细胞损伤，当该通路受到抑制时，软骨细胞自噬水平增强，可适当对抗或延缓软骨细胞的炎症和病变过程。

此外，在KBD和OA软骨病变中，细胞自噬活性缺陷可能与线粒体功能障碍有关。软骨细胞自噬水平下降可导致细胞内受损或衰老细胞器的分解过程受阻，线粒体功能出现障碍[45]，而存在功能障碍的线粒体将产生高水平的活性氧，所造成的炎症、氧化应激和能量代谢障碍又是软骨细胞发生自噬及损伤的重要诱因[46]。有研究表明，PI3K/AKT信号转导与线粒体氧化应激水平负相关，17β-雌二醇可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制小鼠软骨细胞ATDC5的线粒体自噬[47]，提示PI3K/AKT信号通路还可能调控了软骨细胞的线粒体自噬，但目前尚没有更多的证据解释线粒体功能障碍或自噬与软骨细胞自噬的具体关联，及其在OA和KBD发病中的作用。

4 展 望

在既往研究中，PI3K/AKT信号通路已被证实具有促进软骨细胞增殖和抗凋亡作用。然而，关于PI3K/AKT信号通路在软骨细胞损伤和自噬过程中的调控作用尚处在初步探索阶段。PI3K/AKT信号通路可通过抑制细胞自噬活性引起KBD和OA的软骨细胞损伤。大多数针对KBD的自噬研究认为，KBD软骨细胞自噬功能存在障碍或缺陷，部分研究认为PI3K/AKT通路在KBD软骨细胞中呈现激活或上调状态，发挥对自噬活性的抑制作用。尽管已有部分研究提出PI3K/AKT信号通路在KBD软骨细胞自噬中起到抑制作用，然而，现有研究基本都是使用成年人的样本（众所周知，KBD发病的年龄阶段主要是在儿童和青少年时期），不够全面；同时，也没有针对同OA那样进行疾病的不同阶段（如疾病早期和晚期）的研究和分析；涉及的报道也大多是通过DNA甲基化、转录组学或蛋白质组学方法开展研究，没有非常确切、直接的证据。对于该信号通路在KBD软骨损伤和自噬过程中的基因、蛋白及细胞水平等仍缺乏大量验证性的研究，PI3K/AKT通路在KBD和OA软骨细胞自噬和损伤中的动态变化和具体机制还有待更深入和细致的验证和补充。未来进一步验证PI3K/AKT信号通路在软骨自噬和损伤过程中的具体机制可作为研究KBD和OA发病机制的方向之一，将为探索骨关节疾病的治疗方案提供科学依据。