基于数据挖掘及网络药理学探讨中药灌肠治疗慢性肾疾病的核心中药及机制

崔移明，彭贵军，胡 心，贺林玉，吴 玉

（1.河南中医药大学第一临床医学院，河南郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院肾病科，河南郑州 450000）

近年来，慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)发病率逐年攀升[1]，基于传统医学——张仲景《伤寒论》蜜煎导法，中药灌肠发挥了其独特优势。本研究以“慢性肾衰竭”或“慢性肾功能不全”或“慢性肾功能衰竭”或“慢性肾脏病”或“CKD”或“CRF”+“中药灌肠”为关键词进行高级检索，检索中国知网（CNKI）建库至今的期刊，筛选出治疗CKD显效的中药灌肠方共276首。利用SPSS Modeler18.0、IBM SPSS Statistics 21统计软件对其进行数据挖掘和规律总结，再通过BATMAN-TCM、TCMSP、Metascape等数据库找出高频核心中药治疗CKD的潜在靶点及信号通路。分子虚拟对接是一种有效的计算方法[2]，可以快速计算小分子（如药物或候选物）与靶蛋白的结合潜力，运用分子对接技术将筛选出的关键靶点与核心中药的关键活性成分进行分子对接，以初步验证中药灌肠核心中药治疗CKD的主要成分与靶点，为后续研究提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 文献来源

以CNKI为数据来源，以“慢性肾衰竭”或“慢性肾功能不全”或“慢性肾功能衰竭”或“慢性肾脏病”或“CKD”或“CRF”+“中药灌肠”为关键词进行高级检索，检索CNKI建库至今的期刊。

1.2 处方筛选

1.2.1 纳入标准①明确诊断为“慢性肾衰竭”或“慢性肾功能不全”或“慢性肾功能衰竭”或“慢性肾脏病”或“CKD”或“CRF”；②有明确疗效标准且总有效率达85%以上的临床研究；③单纯中药灌肠或中药灌肠结合其他方法治疗；④方剂中药味具体完整。

1.2.2 排除标准①动物实验、名家经验介绍、理论探讨等非临床研究；②中药灌肠方剂仅有方名或具体用药不完整；③治疗方法不是中药灌肠，而是中药内服、中药外敷或西药抗生素灌肠等；④重复发表或处方相同的文献，仅选取其中1篇；⑤总有效率低于85%；⑥中药灌肠治疗未使用统一处方者。

1.2.3 筛选结果根据上述纳入标准及排除标准，共纳入281篇文献，整理后得到276首方剂。

1.3 药名规范与处方录入与审核

1.3.1 药名规范参照《中药学》《中药大辞典》及万方中医药知识库中药分类对方剂中的中药名称进行规范化处理，如“黄花地丁”统称为“蒲公英”；将“煅龙牡”拆分成“煅龙骨，煅牡蛎”；将“生、淡附片，熟附子，炮附子”统称为“附子”，“槐花、槐米”统一为“槐花”；“崩大碗”统称为“积雪草”；“元明粉”统称为“芒硝”等。

1.3.2 处方录入与审核将筛选出的处方录入到WPS Excel表格中，录入格式（编号，中药）建立数据库，对其中的中药字段采用二值属性（该药出现则录入为1，未出现则录入为0），由第2人对录入资料进行核对及补漏，并多次数据审查，以确保其准确性。

1.4 数据挖掘方法

采用SPSS Modeler18.0统计软件，进行统计处理和关联规则分析，采用IBM SPSS Statistics 21统计软件进行聚类分析，利用Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理。

1.5 网络药理学分析

1.5.1 核心药物活性成分筛选及靶点预测利用TCMSP数 据 库[3]（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以肠上皮渗透性（Caco-2）≥-0.4 nm/s，（类药性）DL≥0.18为筛选条件，得到药物的活性成分，并利用Uniprot数据库（https://sparql.uniprot.org/）得到有效成分对应的相关靶点。对于在TCMSP数据库中未检索到的中药，应用BATMAN-TCM数据库[4]进行检索补充，设置“药物-靶标”间相似性得分score cutoff≥20，adjustedP-value＜0.05，得到高频核心中药潜在靶点及有效成分，导入WPS Excel表格中。

1.5.2 CKD的靶点筛选本研究将“chronic kidney disease、chronic renal failure”作 为 检 索 词，在Gene-Cards(https://www.gene-cards.org/)、OMIN（https://omim.org/）、Drugbank（https://go.drugbank.com/）、DisGenet（https://www.disgenet.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）等数据库中进行检索，以获得目前已知的与CKD相关的靶点。

1.5.3 关键靶点筛选及“核心药物-成分-靶点-疾病”网络构建利用Venny在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制药物及疾病靶点韦恩图，得到“药物-疾病”交集靶点，并将交集靶点上传至String数据库[5]（https://string-db.org/）中，依据平台特点进行检索，将minimum required interaction score选择：highest confidence0.900，选择hide disconnected nodes in the network进行筛选，下载以string_interactions命名的.tsv文档，将文档数据导入数据可视化处理软件Cytoscape 3.8.2中，并应用Cytoscape 3.8.2软件analyze Network模块对该文件信息进行可视化分析，degree排名前10作为关键靶点。将核心中药与疾病相关各活性成分及交集靶点，导入WPS Excel表格中建立相互对应关系，运用Cytoscape 3.8.2构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。节点（node）代表药物成分、靶点、药物及疾病名称，边（edge）代表各中药与活性成分、活性成分与靶点、疾病与靶点的相互作用关系，并应用Cytoscape3.8.2软件中的CytoNCA插件获取位居前10的关键成分，用于后续验证。

1.5.4 富集分析利用Metascape数据库[6]（https://metascape.org/gp/index.html）对核心靶点进行富集分析，将富集结果导入微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行气泡图绘制。

1.6 分子对接验证

从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库下载靶点的PDB文件，利用PYMOL对受体蛋白进行去水、去配体等操作，从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载活性成分SDF文件，运用open babel软件转换为Mol2格式文件，利用AutoDock-Tools-1.5.6对受体蛋白及配体进行加氢、平衡电荷等操作，保存为pdbqt格式文件，并运用AutoDock-Tools-1.5.6对处理好的活性化合物与靶蛋白进行对接及能量计算，最终运用PYMOL进行绘图。

2 结 果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 用药频次分析录入WPS Excel表格中有281首处方，整理后得到276首方剂，共涉及120味中药，对其进行用药频次统计，提示中药灌肠方中频次≥10次的药物有19味，累计出现1 281次。在全部处方中累计出现频数最高的前5味中药分别是大黄(271次，98.19%)、牡蛎(239次，86.59%)、蒲公英(178次，64.49%)、丹参(124次，44.93%)、附子（87次，31.52%），出现频数≥10的中药见表1。

表1 使用频次≥10的中药Tab.1 Drugs with frequency≥10

2.1.2 高频药物关联规则分析使用SPSS Modeler 18.0统计软件对高频药物(使用频数≥10)进行关联规则分析，使用Apriori建模进一步挖掘不同中药之间的配伍关系，设置最低条件支持度为20%，最小规则置信度为85%，最大前项数为5等条件挖掘出常用方剂中的潜在药物组合，共计得到核心药物组合18种，根据置信度，常用药物组合位居前5位者，分别为“附子-大黄、附子-牡蛎-大黄、牡蛎-大黄、丹参-大黄、蒲公英-大黄”（表2）。应用Cytoscape 3.8.2软件进行可视化分析，频数≥10的药物之间的关联强度见图1。线条越粗表示两种药物间关联度越强。

表2 高频药物间的关联规则分析Tab.2 Analysis of association rules among high-frequency drugs

图1 高频药物关联规则网络图Fig.1 Network diagram of high-frequency drug association rules

2.1.3 高频药物聚类分析使用IBM SPSS Statistics 21统计软件对高频药物(使用频数≥10)进行系统聚类分析，设置最小聚类数为5，最大聚类数为10，最终运用Pearson相关性分析组间变量进行聚类分析，将药物分为4类（图2）。

图2 高频药物聚类分析树状图(频数≥10)Fig.2 Dendrogram of high-frequency drug cluster analysis(frequency≥10)

2.2 网络药理学结果

2.2.1 核心药物及CKD相关靶点的筛选基于TCMSP数据库，BATMAN-TCM数据库获得核心药物“大黄、牡蛎、蒲公英、丹参、附子”的药物成分信息及预测的潜在靶点，将核心药物的潜在靶点及有效成分导入WPS Excel，最终删除重复项，整合得到：大黄有效成分39个，靶点971个；丹参有效成分124个，靶点887个；附子有效成分54个，靶点271个；牡蛎有效成分5个，靶点27个；蒲公英有效成分8个，靶点120个，将所有靶点进行整合，删除重复值，得到药物靶点1 338个。基于Genecards、OMIN、DisGenet等数据库寻找疾病潜在的候选靶标，分别在Genecards、OMIN、Drugbank、DisGenet、TTD、PharmGkb等数据库中输入关键词“chronic kidney disease、chronic renal failure”，分别得到相关靶点“14 546、8 631”、“536、573”、“58、85”、“1 074、1 493”、“6、1”、“175、16”个，其中Genecards数据库筛选Score≥20的基因，将各数据库靶点录入WPS Excel表中，对靶点进行整合，筛选重复值后，最终得到疾病靶点4 112个。部分结果如表3所示（表中主要展示与前10核心靶点相关成分、编码等）。

表3 疾病-药物核心靶点、药物成分的部分展示Tab.3 Disease-drug core targets and partial display of drug components

2.2.2 PPI网络构建及核心靶点筛选将药物及疾病整合后的靶点导入Venny在线平台，生成“药物-疾病”韦恩图（图3），蓝色代表药物靶点，黄色代表疾病靶点，共得到交集靶点659个，将交集靶点数据上传至String平台，下载PPI的TSV数据文件，导入Cytoscape 3.8.2软件，并应用Cytoscape3.8.2软件analyze Network模块对该文件信息进行拓扑分析，选取平均度值≥12.306 620 21的靶点174个，再次上传至String数据库，选择高置信值0.900，选择hide disconnected nodes in the network，最终得到173个核心靶点，下载PPI的TSV数据文件，导入Cytoscape 3.8.2软件获得蛋白互作网络图（图4），图中共有节点173个，2 072条边，并应用Network Analyzer工具进行拓扑分析，节点大小和颜色深浅反映度值大小，将度值前10作为关键靶点，度值TOP10，见表4。

表4 核心靶点蛋白互作度值前10位Tab.4 Top 10 core target protein interaction values

图3 药物靶点与疾病靶点韦恩图Fig.3 Venn diagram of drug targets and disease targets

图4 核心靶点蛋白互作网络图Fig.4 Diagram of the core target protein interaction network

2.2.3 “核心药物-成分-靶点-疾病”网络构建结果将核心中药各活性成分及获取的核心靶点，导入WPS Excel表格中建立相互对应关系，部分结果如表3所示（表中主要展示与核心靶点前10相关成分、编码等）。运用Cytoscape 3.8.2软件构建“核心药物-成分-靶点-疾病”网络图（图5）。图中共有节点327个，1 367条边，并用“Network Analyzer”功能对该网络进行拓扑分析。结果表明，各成分依据度值高低排序，排名前10的成分为“progesterone（黄体酮）、neocryptotanshinone ii（新隐丹参酮Ⅱ）、dihydrokaranone（二氢卡拉酮）、tanshiquinone B（丹参醌B）、miltiononeⅠ（丹参酸醌Ⅰ）、neotanshinone C（丹参新醌丙）、apigenin（芹菜素）、luteolin（木樨草苷）、ursolic acid（熊果酸）、emodin（大黄素）”，其中大黄成分progesterone（黄体酮）位居首位，说明大黄成分progesterone在核心灌肠药物治疗CKD中起主要作用。

图5 核心药物-成分-靶点-疾病网络图Fig.5 Core drug-component-target-disease network diagram

2.2.4 GO、KEGG富集分析将173个核心靶点导入到Metascape数据库进行GO、KEGG富集分析，以P＜0.01为筛选条件，得到GO条目共7 893条，其中生物学进程（biological process,BP）6 556条，细胞组分（cellular component,CC）519条，分子功能（molecular function,MF）818条，靶点主要参与对生长因子的反应、凋亡信号通路、细胞应激反应的调节等生物学过程，影响转录因子、蛋白激酶活性以及细胞因子受体的结合等，在膜筏、转录调节复合体、胞体等处发挥作用（图6）。KEGG富集条目共425条通路，选取P值最小20个条目进行绘图，核心靶点主要富集在PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、VEGF信号通路等通路（图7）。

图6 GO功能富集分析气泡图Fig.6 Bubble chart of GO function enrichment analysis

图7 KEGG富集分析气泡图Fig.7 KEGG enrichment analysis bubble chart

2.3 活性成分与关键靶点的分子对接

将“2.2.3”项获取的活性成分“progesterone（黄体酮）、neocryptotanshinoneⅡ（新隐丹参酮Ⅱ）、dihydrokaranone（二氢卡拉酮）”等与“2.2.2”项得到的关键靶点“SRC、MAPK 3、PIK 3R1”等，利 用AutoDock Tools-1.5.6软件进行分子对接。本文主要选取活性成分progesterone（黄体酮）与10个关键靶点进行分子对接验证，对接结果如表5，受体与配体对接结合能均小于-5.0 kcal/mol，则表明结合活性较强，且结合能越小表明对接越稳定[2]；利用PyMOL软件对靶点蛋白与成分对接的最佳构象进行可视化分析，直观展示其构象关系，以活性成分progesterone（黄体酮）为例（图8）。

图8 分子对接模式图Fig.8 Molecule docking mode diagram

表5 分子对接结果Tab.5 Molecular docking results

3 讨 论

传统医学虽未提及本病病名，依据其临床表现，可将本病归属于“水肿、关格、癃闭、虚劳”等范畴[7-8]，当今医家对其病因病机各抒己见。秦建国教授[8]认为慢性肾脏病的核心病机是肾络瘀损；而赵玉庸教授[9]提出了本病“肾络瘀阻”病机学说，认为应以益气活血通络为法；权浩浩等[10]认为本病应以“扶正祛邪”为治疗大法，扶正者补肾健脾也，祛邪者化湿、降浊、活血。治疗多标本结合，内外同治。传统医学认为肾者，作强之官，技巧出焉，主司二便，诚如《素问·金匮真言论》云：“北方黑色，入通于肾，开窍于二阴，藏精于肾……”。因此，外治法——中药灌肠，通过肠道吸收治疗本病发挥着独特优势。此类思想与本研究聚类分析结果不谋而合。对频次≥10的药物进行聚类分析，可将药物分为4类，1类：丹参、白花蛇舌草、黄芪、赤芍、当归、桃仁、红花，主打益气活血化瘀；2类：川芎、大黄、芒硝、附子、益母草，主泄浊温通；3类：甘草、六月雪、槐花、土茯苓，主解毒，通利，止血；4类：龙骨、牡蛎、蒲公英，主潜阳敛阴，利湿通淋。

基于CNKI数据挖掘发现，高频灌肠药物位居前5者为“大黄、牡蛎、蒲公英、丹参、附子”，其中大黄的频率高达98.19%，与后续网络药理学预测成分排名，大黄成分Progesterone（黄体酮）位居首位相符。对高频药物进行Apriori建模，依据置信度、增益值及各药物频次，选取“大黄、牡蛎、蒲公英、丹参、附子”作为核心药物，其中大黄通腑泄浊，破血逐瘀，可清除CKD患者肠道中的氮质废物，可以减轻炎性细胞的浸润，对肾功能的改善有调节作用[11]；牡蛎软坚散结，

潜阳敛阴，具有增强免疫力，抗疲劳，抑制肠道有害菌群的作用[12]；蒲公英利尿通淋散结，具有抗炎抑菌，增强免疫力，抗疲劳等作用[13]；丹参活血祛瘀，具有抗炎、抗氧化、肾保护作用及防治肾间质纤维化[14-15]；附子补火助阳，回阳救逆，具有抗炎、免疫调节及改善肾功能等作用[16]。由此可见核心药物在改善肾功能、抗炎及增强免疫力方面有独特优势。

研究发现核心药物治疗CKD的核心靶点有173个，对其进行网络可视化分析后，核心靶点的中药成分有149个，对“药物-成分-靶点-疾病”网络图进行拓扑分析，核心药物治疗CKD以大黄、丹参活性成分为主。ZENG等[17]将大黄素以结肠冲洗方式作用于5/6肾切除大鼠，发现大黄素可能通过调节肠道菌群，减少尿毒症毒素，延缓肾损伤。一项Meta分析发现，丹参酮可降低CKD患者尿蛋白、改善肾功能，延缓CKD进展[18]；同时，WANG等[19]将丹参酮IIA应用于5/6肾切除大鼠，发现丹参酮IIA可抑制胶原蛋白、炎症因子蛋白的表达，起到抗纤维化、抗炎作用，其机制可能与TGF-β/Smad和NF-κB通路有关。

富集分析发现，靶点主要参与对生长因子的反应、凋亡信号通路、细胞应激反应的调节等生物学过程，影响转录因子、蛋白激酶活性及细胞因子受体的结合等，在膜筏、转录调节复合体、胞体等处发挥作用，核心靶点可能作用于PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、VEGF信号通路等发挥调节作用。其中，Jak-STAT信号通路不仅在肾间质纤维化，肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）进程中起着重要作用，还参与介导糖尿病肾病足细胞自噬[20-21]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）信号通路是一个与细胞增殖、分化、凋亡有关的信号通路。研究表明，Nrf2抗肾间质纤维化作用与抑制PI3K-Akt信号通路激活有关[22]，与吡菲尼酮通过抑制PI3K-Akt信号通路，达到减轻UUO大鼠肾间质纤维化，改善肾功能不谋而合[23]。MAPKs是一组进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由ERK 1/2、P38、JNK等组成[24]，其中p38 MAPK能激活肾组织炎症细胞的活化和增殖[25]，受AGE-RAGE通路的调控[26]。研究发现，通腑泄浊方可下调TGF-β1、p-p38 MAPK蛋白表达，延缓肾脏纤维化进展，其机制可能与TGF-β1/p38 MAPK信号通路的抑制相关[27]。同时，有研究证实，抑制EMT进展、抑制TGF-β/Smad和MAPK信号通路，灵芝酸减轻了单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠的肾小管损伤和肾间质纤维化[28]。AGERAGE信号通路通过参与氧化应激，介导炎症，致使内皮功能异常，抑制内皮型一氧化氮合酶，导致肾功能受损[29-30]；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促进内皮细胞的增殖、迁移和机体血管形成[31]，VEGF信号通路与肿瘤、血管内皮损伤、视网膜血管病变、肾脏纤维化病变等疾病相关[31-32]。一项研究将姜黄素应用于5/6肾切除大鼠，进一步证实了VEGF信号通路是肾脏疾病发病过程中的重要信号通路[33]。

分子对接验证结果显示，靶点蛋白与分子配体结合能均＜-5.0 kcal/mol，表明亲和力较强，对接较稳定。

综上所述，本文通过对中药灌肠治疗CKD有效处方的整理，基于关联规则及聚类分析，得知中药灌肠治疗CKD的药物组合及用药规律，为临床中药灌肠提供理论支持。通过网络药理学预测灌肠核心中药治疗CKD的潜在靶点及可能作用机制，利用分子对接技术对活性成分及靶标蛋白匹配度进行反向验证，为中药灌肠治疗CKD的后续实验研究提供基础，同时为拓展临床思路提供方向。本研究虽揭示了中药灌肠治疗本病的疗效，但其作用机制、途径等仍需药理学实验的验证。在此基础上，可通过体内、外实验来验证成分和靶点之间的作用关系，深入揭示灌肠核心中药治疗CKD的物质基础及机制。