亚甲蓝对阿尔茨海默症大鼠认知功能障碍及RhoA/ROCK2通路的影响

赵庆利，吴 师，周裕凯

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性脑疾病，以细胞外β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积、细胞内神经原纤维缠结和线粒体功能障碍为特征，导致不可逆转的记忆缺陷、异常行为和人格改变［1］。目前，AD还没有治愈的方法，治疗只能改善症状，并不影响疾病的进展。RhoA/Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho-associated coiled coilforming protein kinase 2，ROCK2）信号通路与神经系统的生理作用密切相关，抑制RhoA/ROCK2信号通路，可改善老年小鼠的认知功能障碍［2］。亚甲蓝（methylene blue）是一种具有悠久临床应用历史的杂环芳香族化合物，先前的研究表明，亚甲蓝对多种神经退行性疾病具有神经保护作用，可明显改善AD大鼠的记忆力退化［3］。多奈哌齐作为第2代胆碱酯酶抑制剂，在临床上对轻中度阿尔茨海默症有较好疗效。因此本研究拟通过Aβ诱导，构建AD大鼠模型，以多奈哌齐为阳性药物，探究不同剂量亚甲蓝对AD大鼠的神经保护作用以及对RhoA/ROCK2信号通路的影响。

1 材料及方法

1.1动物 成年雄性Wistar大鼠，体质量（250±20）g左右，购自兰州大学实验动物中心，许可证号：SYXK（甘）2018-0002。实验开始前，将大鼠置于室温（22±1）℃、明暗周期12 h、湿度60%的环境中，在通风良好的地方适应性饲养1周，自由采食饮水。本研究中使用的所有程序都是在实验动物的指导原则下进行的，并得到本院伦理委员会的批准。

1.2主要试剂 亚甲蓝，纯度≥98%，货号：M8030，购自北京索莱宝生物科技有限公司。盐酸多奈哌齐片，国药准字H20070181，购自卫材（中国）药业有限公司。丙二醛（MDA）检测试剂盒（S0131），超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（S0101），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（PT516），白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒（PI303）均购自上海碧云天科技有限公司。乙酰胆碱酯酶（Ache）测试盒（A024）购自南京建成生物工程研究所。RhoA抗体 （ab187027）、ROCK2抗体（ab125025）及β-肌动蛋白抗体（ab8226）均购自美国Abcam公司。

1.3实验仪器 脑立体定位仪（美国Stoelting公司），全自动生化分析仪（上海帝博思生物科技有限公司），光学显微镜（日本尼康公司），蛋白电泳仪、半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像仪（Miulab公司）等。

1.4实验方法

1.4.1AD动物模型的制备 按照文献［4］的方法，在大鼠侧脑室注射Aβ1-42寡聚物诱导AD大鼠模型。首先将大鼠麻醉并置于脑立体定向仪中，通过不锈钢套管将Aβ1-42寡聚物注入双侧脑室中，每侧5μl，位置为前囟点后1.1 mm，矢状缝线外侧2.2 mm，硬脑膜以下3.0 mm处。手术7 d后采用行为学测试以判断AD模型是否构建成功。空白对照组大鼠通过使用上述坐标，在双侧脑室中注入同剂量媒介体作为对照。实验过程中，若动物死亡，则进行补充，以保障每组不少于10只。

1.4.2动物分组及样本采集 造模成功后，将AD大鼠分成模型组、亚甲蓝低剂量组、亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐（阳性对照）组，每组10只。另外10只大鼠为空白对照组。分别给予亚甲蓝低剂量组、高剂量组2和8 mg/kg的剂量腹腔注射，多奈哌齐组给予1.5 mg/kg的剂量腹腔注射［5］。空白对照组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射，连续28 d。各组大鼠于给药后第29～33 d进行Morris水迷宫检测。然后收集尾静脉血清置于-20℃中保存。从每组大鼠中随机选择5只，先用生理盐水进行灌注，然后用10%甲醛快速固定海马组织。每组中另外5只大鼠处死后分离海马组织，液氮冷冻保存于-80℃进行生化分析。

1.4.3Morris水迷宫 Morris水迷宫实验在一个直径94 cm，深31 cm的圆形白色水池中进行，水深30 cm，温度为25℃，用25 cm2的有机玻璃正方形作为逃生平台，放置在水池中心距水池边缘15 cm处，淹没在水面以下1 cm处。将池分成4个相等的象限，先将大鼠在平台上放置30 s，然后放置在起始点。如果这些大鼠在90 s内到达平台，它们将被允许在平台上停留30 s。如果在90 s未能到达平台，则将大鼠引导至平台并停留30 s，训练5 d，每天3次，每隔10 min进行1次训练。隐藏平台测试完成后，先将平台移出水池。然后将大鼠放在距离最初平台最远的象限，记录大鼠穿越原平台位置的次数和在目标象限游泳的时间。

1.4.4生化指标的检测 利用试剂盒检测大鼠血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。利用乙酰胆碱酯酶（Ache）比色法检测大鼠海马组织中Ache活性。利用ELISA试剂盒检测海马组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）浓度。具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.4.5海马组织病理学检测 大鼠海马组织在10%甲醛中放置24 h后，脱水透明，制作石蜡切片，厚度为4μm，然后使用苏木精-伊红（HE）染色，然后将海马切片固定在玻片上风干，在光学显微镜下观察海马组织的形态学变化。

1.4.6TUNEL染色观察海马神经细胞凋亡 对1.4.5制备的石蜡切片进行TUNEL染色，凋亡细胞的细胞核呈棕色，凋亡指数以随机选取的100个神经细胞中凋亡细胞的百分比计算。用图像分析系统计算凋亡细胞阳性率。

1.4.7Western blot检测大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平 取-80℃中保存的0.25 g海马组织，用含蛋白酶抑制剂的500μl RIPA裂解缓冲液制备总蛋白裂解液，在4°C下12 000 r/min离心5 min得到上清液。同时，提取总蛋白并用BCA法测定总蛋白浓度。将50μg蛋白裂解产物煮沸5 min，SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。然后，使用硫代巴比妥酸缓冲液封闭膜，并与RhoA、ROCK2一抗（稀释倍数1：1 000）在4℃下过夜孵育。接下来，将膜与辣根过氧化物酶偶联二抗孵育2 h，用ECL试剂盒显影，以β-肌动蛋白为内参，分析蛋白条带相对表达量。

1.5统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行数据分析，统计数据以（±s）表示，Morris水迷宫用重复测量的方差分析，组间多重比较用Games-Howell法；其余数据用单因素方差分析，组间多重比较用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1亚甲蓝对AD大鼠认知功能的影响 与空白对照组相比，AD大鼠表现出明显延长的逃避潜伏期，减少的跨平台次数和目标象限内游泳时间，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠逃避潜伏期明显缩短，跨平台次数和目标象限内游泳时间显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐组大鼠的水迷宫测试结果的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 Wistar大鼠莫里斯水迷宫测试结果（±s）

表1 Wistar大鼠莫里斯水迷宫测试结果（±s）

注：与对照组相比，a P＜0.05；与模型组相比，b P＜0.05；与亚甲蓝低剂量组相比，c P＜0.05

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2.2亚甲蓝对AD大鼠血清中MDA和SOD水平的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠血清中SOD水平显著降低，MDA活性显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠血清中SOD水平显著升高，MDA活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐组大鼠血清中MDA和SOD水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 亚甲蓝对AD大鼠血清中MDA和SOD水平的影响（±s）

表2 亚甲蓝对AD大鼠血清中MDA和SOD水平的影响（±s）

注：与对照组相比，a P＜0.05；与模型组相比，b P＜0.05；与亚甲蓝低剂量组相比，c P＜0.05

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2.3亚甲蓝对AD大鼠海马组织中的Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠海马组织中Ache活性、TNF-α和IL-1β水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中Ache活性、TNF-α和IL-1β水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 亚甲蓝对AD大鼠海马组织中的Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的影响（±s）

表3 亚甲蓝对AD大鼠海马组织中的Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的影响（±s）

注：与对照组相比，a P＜0.05；与模型组相比，b P＜0.05；与亚甲蓝低剂量组相比，c P＜0.05

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2.4亚甲蓝对AD大鼠海马组织病理变化的影响空白对照组大鼠海马组织结构正常，细胞排列紧密有序，细胞核大而圆，染色浅，核仁清晰，无明显神经细胞变性和损伤的迹象。模型组AD大鼠神经细胞排列疏松，数量减少，梭形，形态不规则，胞浆凝聚导致细胞体积缩小，核固缩，染色深染。亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中细胞排列较为紧密有序，细胞数量增加，核仁较为清晰，有明显的改善。见图1。

图1 Wistar大鼠海马组织HE染色图（200×）

2.5亚甲蓝对AD大鼠海马组织神经元凋亡的影响 与空白对照组（8.15±2.43）%相比，模型组大鼠海马组织中细胞凋亡率显著升高 （65.82±10.59）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中细胞凋亡率显著降低（40.73±11.61）%、（15.24±8.45）%、（17.47±9.02）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中细胞凋亡率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6亚甲蓝对AD大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。亚甲蓝高剂量组核和多奈哌齐组大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 亚甲蓝对AD大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平的影响（±s）

表4 亚甲蓝对AD大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平的影响（±s）

注：与对照组相比，a P＜0.05；与模型组相比，b P＜0.05；与亚甲蓝低剂量组相比，c P＜0.05

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3 讨论

AD是一种进行性神经退行性疾病，表现为大脑功能障碍，影响语言、认知和情绪［6］。在过去的几十年里，AD的研究取得了巨大的进展，但其确切病因仍不清楚，目前还没有有效的治疗或预防策略。亚甲蓝是一种历史悠久的药物，药理复杂，已证实，亚甲基对AD、帕金森病、中风、神经病变以及体外星形胶质细胞和肝细胞缺氧性损伤模型具有神经保护作用［7］。另外，亚甲蓝可以减少淀粉样斑块和神经原纤维缠结的形成，并能部分保护线粒体功能［8］。本研究在大鼠双侧脑室注射Aβ1-42寡聚物后发现，AD大鼠神经细胞排列疏松，形态不规则，海马神经元凋亡率增加，水迷宫检测结果显示大鼠逃避潜伏期延长，跨平台次数和目标象限内游泳时间减少，揭示AD大鼠模型构建成功。AD大鼠在亚甲蓝给药后，认知能力明显改善，镜下可见海马神经细胞数量增加，细胞凋亡率降低，表明亚甲蓝对AD大鼠具有明显的神经保护作用。

乙酰胆碱是一种胆碱能神经递质，被认为与学习和记忆密切相关［9］。Ache是乙酰胆碱水解的关键酶，Ache活性增强导致乙酰胆碱的水解增加，从而导致胆碱能神经传递的下降，这与AD呈正相关［10］。在AD大鼠海马组织中，Ache活性升高，经亚甲蓝和多奈哌齐给药后，明显逆转了这种现象。其中，高剂量亚甲蓝与多奈哌齐对AD大鼠的治疗效果相当。氧化应激是AD发生和发展的重要因素。自由基的过量产生会导致生物大分子的氧化损伤，导致神经元损伤和认知障碍［11］。此外，氧化应激参与神经病理改变，包括神经元凋亡、神经原纤维缠结、线粒体功能障碍和淀粉样蛋白沉积，这些都参与了AD的发病机制［12］。在本研究中，亚甲蓝减轻了AD大鼠血清中的SOD活性，提高了MDA水平，表明亚甲蓝减轻了AD大鼠体内的氧化应激反应。神经炎症是AD的早期事件，在AD的发病机制中起着关键作用，同样参与淀粉样蛋白沉积、神经元损伤、胆碱能功能障碍和死亡［13］。在本研究中，亚甲蓝可显著降低AD大鼠海马组织中TNF-α和IL-1β水平。IL-1β和TNF-α是脑内最常被研究的促炎细胞因子，导致AD学习和记忆障碍［14］。此外，神经炎症被认为是慢性氧化应激的结果，继发于神经元损伤。自由基的过度产生可能会影响转录因子的数量，导致促炎细胞因子的过度产生［15］。因此，推测抗氧化和/或抗炎治疗可被认为是治疗AD的潜在策略。

RhoA属于Rho家族，是一种GTP酶。当小胶质细胞受到受损神经元和促炎因子的刺激时，它们会激活RhoA及其下游效应激酶ROCK（两种亚型ROCK1和ROCK2）。ROCK2主要存在于神经中枢并高度表达［16］。ROCK2在抑制中枢神经系统生长中起关键作用，并被多种抑制性受体激活［17］。因此，ROCK2相关信号通路的抑制对于改善神经炎症具有十分重要的作用。本研究中，AD大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平升高，表明大鼠脑组织受到损伤后，RhoA/ROCK2信号通路被激活。而AD大鼠在亚甲蓝给药治疗后，RhoA、ROCK2蛋白表达水平明显降低，表明亚甲蓝可抑制RhoA/ROCK2信号通路，减轻AD大鼠的神经炎症。

综上所述，亚甲蓝对AD大鼠具有明显的神经保护作用，可能是通过抑制RhoA/ROCK2信号通路，减轻神经炎症和氧化应激反应。然而，AD的发病机制十分复杂，尚不完全清楚，因此，亚甲蓝对AD大鼠的药效作用仍有待于进一步研究。