面向应用创新型本科生培养的生物化学实验教学设计——以GFP蛋白的表达分离纯化为例

徐志霞， 孙 杰， 杨 勇， 丁 利

（海南师范大学生命科学学院，热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南省热带动植物生态学重点实验室，海口 571158）

0 引 言

2015年国务院印发的《统筹推进世界一流大学和一流学科建设总体方案》文件中，对高等教育阶段的人才培养提出了更高的目标［1-2］，如何培养创新型、应用型、复合型人才成为各高校着重考虑的问题［3-4］。实验教学是高等教育的一个至关重要的模块，是学生对理论知识和实践技能有机结合的重要途径，对学生创新思维和应用思维的形成具有重要的作用［5］。在双一流的建设背景下，如何优化实验教学体系，改革实验教学内容，以适应学生对创新与应用的要求，成为一个重要的课题［6-7］。

生物化学实验是生物学专业的核心课程，不仅能为学生专业课的学习打下基础，更是学生开展生命科学研究的必备技能［8-9］。蛋白质的相关实验，如提取、分离、纯化、定量分析等是生物化学实验中很重要的一个模块，在这个模块的传统教学中存在教学形式枯燥、教学内容分散、缺乏连贯性等问题［10］，难以达到预期的课程目标。实验课教学的成效，能否达到课程目的和目标，取决于诸多因素。其中，实验材料的选择，以及教学内容的设计是两个非常关键的因素，直接影响学生学习本门课程的兴趣以及学生创新科学思维的培养。为提高教学效果，培养具有创新性的应用型复合型人才，我院生物化学实验教学采用新型教学模式，以绿色荧光蛋白为实验材料，进行生物化学蛋白质模块的教学，并以此为基础，开展创新型设计性实验，实现理论－实践－创新设计的学习模式，推动培养具有创新能力的应用型复合型人才目标的实现。

1 实验教学材料的优化

在生物化学实验的蛋白质相关实验中，很多高校选用的实验材料为碱性磷酸酶、酵母蔗糖酶等［11］，这类蛋白质表达量低、看不见摸不着，教学过程枯燥，对于初学者来说实验成功率低。为改变生物化学实验内容的枯燥性，同时提高实验的成功率，我院选择绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为蛋白质分离纯化模块的实验材料。GFP是一种分子量为20 kD的生物蛋白，其荧光反应只需紫外光或蓝光激发即可（见图1）。即使该蛋白未经纯化，其发射的绿光也非常强，在正常室内光线下即可辨别［12］。

图1 紫外光下绿色荧光蛋白检验

基于GFP蛋白易于检测，稳定性强的特点，将GFP基因插入到pMAL-c5X载体中构建重组载体，转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）菌株，表达得到重组GFP蛋白，其相对分子质量约为70 kD，N端带有Histag6标签，可进行亲和层析实验，同时其表达量高，实验过程中肉眼可追踪，在蛋白质的分离纯化中是一个非常好用的材料。

2 实验教学内容优化

2.1 重组GFP蛋白的表达

将构建好的表达载体转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）菌株，挑取单克隆菌落，接种到含有50μg／mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。将该5 mL细菌悬浮液转移到150 mL含有50 μg／mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600值为0.6后，加入终浓度为0.1μmol／L的IPTG，28℃继续培养4 h，4 000 r／min、10 min离心收集菌体（见图2），－20℃保存备用。

图2 表达GFP蛋白的菌体收集

2.2 菌体破碎

用40 mL Tris-HCl缓冲液（含20 mmol／L Tris，300 mmol／L NaCl，pH8.0）重悬菌体沉淀，置于冰上进行细胞破碎。在预习实验时，学生提出了3种破碎方案：超声破碎法、反复冻融法和酶溶法。其中超声破碎程序为超声4 s，间歇6 s，持续20 min；反复冻融方法为液氮和室温交替反复冻融3～5次；酶溶法为添加溶菌酶。3种破碎方案的效果比较如图3所示。结果显示超声破碎法效果要明显优于其他两种方法。

图3 不同方法的破碎效果比较

在本实验中，学生充分发挥其主观能动性，将理论知识应用到实验中去。在对结果的分析中，有同学发现酶溶法破碎的菌上清液在14 kD附近有一条蛋白条带，是另外两种破碎方法中所没有的，起初多数同学不清楚这个条带是什么？经过大家查阅文献、分析讨论，确定是溶菌酶。由此，加深了同学们对大多数酶是蛋白质的认识，同时锻炼了其认真细致观察分析实验结果的能力。

2.3 镍离子金属亲和层析

选用超声破碎法破碎菌体后，12 000 r／min，4℃离心30 min，收集上清液进行蛋白质的初步纯化。重组GFP蛋白N端带有His标签，能特异性地结合在镍柱上，而其他非目的蛋白结合力弱，可以用含不同浓度咪唑的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，获得初步纯化的蛋白。本实验采用IDA-Ni预装重力柱，使用含50、100、150、500 mmol／L梯度浓度的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白。将菌悬液、裂解液上清、穿透液（flow through）、不同浓度咪唑洗脱液蛋白进行SDS-PAGE电泳，从电泳结果的图谱（见图4）中可以分析很多信息，充分锻炼考量学生的看图比较分析，得到有效知识点的能力。从图4可见，菌悬液与裂解液上清相比较，在70 kD左右有一条很粗的蛋白条带，表明该重组GFP蛋白的表达量很高，且溶解性好。裂解液上清与穿透液相比较，穿透液中的重组GFP蛋白含量减少了很多，表明大部分目标蛋白质结合在了镍柱上，挂柱效果好，同时非目的蛋白多数未结合在柱子上。从不同浓度的咪唑洗脱液来看，镍柱纯化效果较好，在100 mmol／L咪唑洗脱液洗脱下，目的蛋白的纯度和浓度均较高，但仍有少许不同分子量大小的非目的蛋白存在，需进一步纯化。

图4 镍离子金属亲和层析纯化GFP蛋白SDS-PAGE电泳结果

2.4 离子交换层析

经预实验得知，重组GFP蛋白的等电点在酸性范围内，在pH8.0的Tris缓冲液中带负电荷，因此使用DEAE弱阴离子交换柱进行离子交换层析。在本实验中，学生可使用亲和纯化收集的蛋白质进行离子交换实验，但是要经过脱盐和浓缩处理，耗时较长，课时不允许的情况下可作为学生课后自主探索的内容。本实验直接用超声破碎后的蛋白溶液进行纯化，采用含50、100、200、300、500、1 000 mmol／L梯度浓度NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱目的蛋白。SDS-PAGE电泳结果（见图5）显示，离子交换层析相较亲和层析，纯化效果不佳，但是穿透液的蛋白纯度较高，非目的蛋白几乎不可见，这也不失为提高纯度的一个思路。结合亲和层析的SDS-PAGE电泳图谱来说，二者相结合可达到较为理想的纯化效果。

图5 离子交换层析纯化GFP蛋白SDS-PAGE电泳结果

2.5 凝胶过滤层析

为进一步提高蛋白质的纯度，采用凝胶过滤层析对镍离子金属亲和层析纯化后的蛋白进一步分离纯化。将亲和层析纯化后的蛋白质用超滤管浓缩，得到1 mL高浓度的蛋白溶液便于上样。从洗脱曲线（见图6）可见，得到3个紫外吸收峰，选取主峰的第8管和第9管进行SDS-PAGE电泳检测（见图7），结果显示，经凝胶过滤层析，重组GFP蛋白的纯度明显提高，达到了对目的蛋白分离纯化的目的。

图6 凝胶过滤层析洗脱曲线

3 实验教学考核评价方式改革

经过上述蛋白质纯化的一系列实验，学生系统地掌握了蛋白质的诱导表达、细胞破碎、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、SDS-PAGE电泳等技术，具备了开展相关探究性实验的能力。本课程考核采用开放性项目的形式进行，学生组成4～5人的团队，在生命大分子物质的制备分离的范围内自主选题，利用蛋白质分离纯化及生物化学其他理论和操作技能开展实验，最后成果为分离到一种纯度较高的酶，并在课程结束时，团队进行项目的PPT汇报，最终撰写论文提交。

近年来，在生物技术专业的教学过程中，在自主考核的环节，学生的兴趣和积极性都很高，选题包括了从大蒜中提取纯化超氧化物歧化酶，从鸡蛋清中提取溶菌酶，分离纯化罗汉果蛋白酶、甘薯β-淀粉酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、马铃薯多酚氧化酶、猪胰蛋白酶等，此外，也包含了枯草芽孢杆菌蛋白酶的分离纯化、酵母蔗糖酶的分离纯化、粘质沙雷氏芽孢杆菌杀虫蛋白的分离纯化等。在这个过程中，学生不仅复习巩固了课堂教学过程中的理论知识和实验技术，同时锻炼了查阅文献、独立思考、实验设计、团队协作以及撰写论文的能力。

该考核方式从开放性项目的选题、课题设计到课题的实施、论文撰写、汇报，均以学生为主体，实验室搭建开放平台，指导教师时刻关注学生的实验动态，把控整个考核进度，充分发挥了学生的主观能动性，调动了学生的积极性。

4 教学效果

4.1 实验对象新颖，实验成功率高

生物化学实验侧重于糖和蛋白质的分离鉴定，目前的主流教材实验内容偏单一，蛋白质的分离鉴定的一系列实验彼此间缺乏关联，实验材料多为碱性磷酸酶，看不见摸不着，学生实验过程中成功率低，容易打击学生实验的积极性，教学效果不理想。在以“绿色荧光蛋白”为实验对象的蛋白质分离鉴定的综合性实验中，实验材料变成了能看得见的蛋白质，学生在整个实验过程中能观察到蛋白质的去向，不必等到全部实验结束在SDS-PAGE凝胶上才知道实验的成败与否。

在综合性实验中，围绕绿色荧光蛋白为同一实验对象，将独立的知识点连接成一条线，每个实验内容之间是层层递进的关系，学生能够进行实验数据的纵向和横向比较，更加深入理解实验原理，能够根据实验对象与实验目的选择合适的实验方法，形成多维度的知识体系，达到较好的实验效果。

4.2 促进学生个性化发展

在本综合实验教学模式下，学生基本功扎实，进入相关科研实验室进行科学研究能够迅速进入角色，通过实验考核模式的改革，学生不再是简单的复习就能过关，注重过程而非结果，他们能够结合自己在研究室的科研经历和兴趣点，选择不同的项目主题，利于学生个体差异化的发展。在国家日益提倡大学生进行创新创业训练的环境下，很多学生都有自己的创新项目，接下来的考核中，也可以与学生自己的项目相结合，更大地发挥学生的主观能动性，提高教学效果［13～15］。

4.3 激发学生的探究意识

在本综合实验模式下，不再照本宣科，而是引导学生思考，例如在镍离子亲和层析实验中，给学生讲述清楚洗脱目的蛋白的原理，采用梯度洗脱的方式，而采用何种梯度，学生可以根据自己的实验来调整。而在蛋白质的诱导表达这一节中，因这个实验的特殊性及时间限制，由实验老师进行准备，课堂上只讲述，学生在听的过程中就提出，为什么采用这个温度？IPTG为什么要这个浓度？改变这两个条件会发生什么变化？于是有几组同学就进行了探究，分别设置温度梯度和IPTG浓度梯度来进行探究，最后呈现的效果是非常好的，学生对蛋白质诱导表达的理解也更为深刻了。

5 结 语

通过以绿色荧光蛋白为实验材料的蛋白质分离纯化这个综合性实验项目以及以本项目为基础的实验考核方式的改革，大大提高了学生学习探究的兴趣，提高了学生学习的自主性，同时也极大地提升了学生创新研究的能力。自2015年本综合性实验项目在生物技术专业实施以来，经过不断摸索，教师和学生的默契度不断提升，实验体系已逐渐成熟，取得了较好的教学效果，修过该课程的同学进入科研实验室能很快进入角色。至于实验考核逐渐过渡到学生自己参与的项目驱动式的考核方法还需要在实践中不断地摸索改进。