IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多态性和复发性流产的相关性①

刘 倩 李亚梅 陈丽娜 李 静 裴建赢 王燕侠 毛宝宏（甘肃省妇幼保健院科研中心，兰州 730050）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一种常见的妊娠并发症，其病因复杂，年龄、生活方式、遗传、内分泌、解剖和免疫等多种因素均与其发病有关［1］。研究发现促炎和抗炎细胞因子之间的生理平衡对胚胎着床和维持妊娠至关重要［2］。促炎细胞因子包括Th1 型细胞因子（如IFN-γ 和TNF-α）和其他细胞因子（如IL-1β和IL-6），而抗炎细胞因子是Th2 型的细胞因子（如IL-4 和IL-10）和其他细胞因子（如TGF-β1）［3］。IL-4可促进Th细胞分化为Th2效应细胞，并通过与其受体IL-4Ra 结合激活信号通路来发挥抗炎作用［4］。既往研究关于IL-4基因多态性和RSA 的相关性结果并不一致［5-6］，且IL-4R 基因多态性和RSA 的相关性研究尚未见报道，为进一步明确这两个基因多态性与RSA 的关系，本研究应用SNaPshot 技术对IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010基因多态性进行分型，评估其对RSA 发病的影响，以期为临床诊断RSA提供早期分子标志物。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 患者信 息 RSA 组：选取2019 年1 月至2020 年8 月就诊于甘肃省妇幼保健院RSA 门诊的至少有过3 次流产的妇女150 例作为RSA 组，RSA的诊断根据2016年我国“复发性流产诊治的专家共识”标准［7］。诊断和排除标准：①妊娠28 周前发生自然流产至少3 次；②夫妇双方不存在异常染色体核型；③无生殖器解剖学畸形；④内分泌功能正常；⑤无血栓前状态、低纤维蛋白血症及血小板增多症；⑥ACA、β2 球蛋白、抗甲状腺抗体等自身抗体阴性；⑦排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等传染性疾病；⑧排除宫外孕、生化妊娠、计划流产、意外流产等妊娠史。健康对照组：选取与RSA 组同一时段于甘肃省妇幼保健院健康管理中心进行体检的女性健康志愿者150 例作为对照组。诊断和排除标准：①既往无自然流产、宫内生长迟缓及胎儿先天缺陷等不良孕产史；②至少有过1次正常生育史；③排除高血压、糖尿病、肝肾、内分泌、免疫异常等全身性或基础性疾病。所有研究对象均阅读并签署知情同意书。本课题经甘肃省妇幼保健院伦理委员会批准，并符合《赫尔辛基宣言》。

1.1.2 试剂与仪器 人类基因组DNA 提取试剂盒（中国北京天根生化科技有限公司）；GC-Ⅰbuffer（TaKaRa）；HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.）；虾碱酶（Promega）；外切酶Ⅰ（Epicentre）；SNaPshot Multiplex Kit（ABI）；FR-110 紫外分析仪、FR-250 电泳仪（上海复日科技有限公司）；凝胶成像仪（上海培清科技有限公司）；2720 Thermal Cycler 扩增仪、3730xl genetic analyzer分析仪（美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有研究对象空腹12 h 后于次日清晨采集外周血3 ml于EDTA-K2抗凝管并分装冻存于-80℃冰箱。同时收集并记录患者的年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）、焦虑自评量表（self-rating anxiety scale，SAS）和抑郁自评量表（selfrating depression scale，SDS）评分等一般资料。

1.2.2 DNA 提取 取出之前分装保存的EDTA 抗凝剂全血，全基因组DNA 的提取根据DNA 提取试剂盒说明书进行。使用分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度，DNA 浓度＞20 ng/µl，A260/A280≈1.8，A260/A230＞2.0，则DNA 提取成功，可以继续进行下一步实验。

1.2.3 基因分型 本实验利用SNaPshot SNP 分型技术进行分型。引物用在线Primer3 软件设计（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及长度见表1。采用20 µl PCR 扩增体系：去离子水5 µl，2×GC-Ⅰbuffer 10µl，3.0 mmol/L Mg2+0.4µl，0.3 mmol/L dNTP 2.4 µl，1 U HotStarTaq polymerase 0.2 µl，样本DNA 1µl 和多重PCR 引物1µl。扩增程序如下：95℃2 min；94℃20 s，65℃（-0.5℃/循环）40 s，72℃1.5 min，11 个循环；94℃20 s，59℃30 s，72℃2 min，24个循环；72℃2 min。将5 U虾碱酶和2 U外切酶Ⅰ加入10 µl PCR 产物中，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min 进行纯化。之后进行SNaPshot 多重单碱基延伸反应，体系（10 µl）包括5 µl SNaPshot Multiplex Kit，2 µl 纯化后的多重PCR 产物，1 µl 延伸引物混合物，2µl 超纯水。程序如下：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，28 个循环。然后在10µl延伸产物中加入1 U 虾碱酶，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min 进行纯化。最后取0.5 µl 纯化后的延伸产物，与0.5 µl LIZ 120 Size Standard 和9 µl Hi-Di 混匀，95℃变性5 min后上3730XL测序仪进行测序，测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1分析。

表1 IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 引物序列和PCR产物长度Tab.1 Primer sequences and length of PCR products of IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010

1.3 统计学处理 对IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 位点基因型分布进行Hardy-Weinberg（HWE）平衡检验，P＞0.05 表示符合HWE 平衡检验。采用χ2检验进行组间基因型和基因频率对比（显著性水平α=0.05），基因型与RSA 的相关性采用优势比（odd ratio，OR）及其95%可信区间（95%confidence interval，95%CI）表示，统计分析采用SPSS26.0软件进行，Logistic二元逐步回归进行多因素分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RSA 组和正常对照组基本信息 RSA 组和正常对照组间年龄、BMI、民族、吸烟史、饮酒史、SAS和SDS 积分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。两组间的居住地和家庭收入比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 RSA组和对照组女性人口学和临床特征Tab.2 Demographic and clinical characteristics of RSA group and control group

2.2 IL-4 基 因rs2243250 和IL-4R 基 因rs1805010在RSA 与对照人群基因多态性分析 对照组人群IL-4 基因rs2243250 和IL-4R 基因rs1805010 位点符合HWE 平衡分析（P均＞0.05）。RSA 组人群IL-4 基因rs2243250 位点TT 基因型分布频率为58.7%，TC基因型为35.3%，CC 基因型为6.0%，对照组人群中rs2243250 位点TT 基因型分布频率为60.0%，TC 基因型为35.3%，CC 基因型为4.7%。对IL-4 基因rs2243250 位点在RSA 和对照组人群中的基因型分布进行比较，结果显示差异无统计学意义（P=0.87），见表3。

RSA 组人群IL-4R 基因rs1805010 位点GG 基因型分布频率为34.7%，GA 基因型为42%，AA 基因型为23.3%，对照组人群中rs1805010 位点GG 基因型分布频率为21.3%，GA 基因型为52%，AA 基因型为26.7%。对IL-4R 基因rs1805010 位点在RSA 和对照组人群中的基因型分布进行比较，结果显示差异有统计学意义（P=0.04）。携带有GA 基因型的人群RSA 发病风险降低（OR=0.50，95%CI=0.29～0.86），经校正年龄、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回归分析显示携带有GA 基因型的人群RSA 发病风险仍降低（OR=0.55，95%CI=0.30～0.99），见表3。

表3 IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多态性和RSA发病的相关性Tab.3 Association between IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010 gene polymorphisms and risk of RSA

2.3 不同遗传模式下IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 基因多态性和RSA 发病的相关性 在等位基因遗传模式下，RSA 组和对照组IL-4R rs1805010 位点A 等位基因分布差异有统计学意义（P=0.041），携带有A 等位基因的人群RSA 发病风险低于G 等位基因（OR=0.71，95%CI=0.52～0.99），经校正年龄、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回归分析显示携带有A 等位基因的人群RSA 发病风险仍降低（OR=0.71，95%CI=0.51～0.99）。同时在显性遗传模式下，RSA 组和对照组IL-4R rs1805010位点AA+GA 基因型分布差异有统计学意义（P=0.01），携带有AA 和GA 基因型的人群RSA 发病风险低于GG 基因型（OR=0.51，95%CI=0.31～0.86），经校正年龄、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回归分析显示携带有AA 和GA 基因型的人群RSA 发病风险仍降低（OR=0.49，95%CI=0.29～0.85），见表4。

表4 不同遗传模式下IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多态性和RSA发病的相关性Tab.4 Association between IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010 gene polymorphisms and risk of RSA under different inheritance models

3 讨论

RSA 不仅会给孕妇和家庭造成极大的心理压力和经济负担，同时还会影响后期的妊娠结局。近年来免疫失调被认为是导致RSA 的潜在机制，正常妊娠过程倾向于Th2 型免疫反应，而有RSA 病史的女性倾向于Th1 型免疫反应［8］。Th1 型免疫反应是早期着床需要的，而妊娠的维持依赖于Th2 型抗炎细胞因子或Treg［9］。IL-4作为Th2型抗炎细胞因子，对Th1 型细胞因子发挥拮抗作用，可通过与其受体IL-4Ra 结合促进胚胎发育和胎盘形成，对妊娠成功起重要作用［10］。单核苷酸多态性可能通过改变基因的功能或转录活性从而影响蛋白的活性或表达，因此本研究探讨IL-4 和IL-4R 基因多态性与RSA 发病间的相关性，以期为临床从分子学水平诊断RSA提供参考。

本研究人口学和临床资料统计显示居住地和家庭月收入在RSA 和健康志愿者间差异有统计学意义。居住地对RSA 妊娠结局的影响可能主要与居住环境因素有关，有研究显示，居住环境有噪音和难闻性气味均是发生RSA 的独立危险因素［11］。BRUCKNER 等［12］报道低收入女性群体相较于高收入群体其焦虑和抑郁程度更高，不良心理状态可作用于神经系统，使交感神经和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴调节途径异常，进而经双向调节影响机体的免疫功能［13］。关于居住地和家庭月收入对RSA 的影响还需进一步研究，同时本研究纳入的环境和社会危险因素有限，应进一步加强RSA 风险因素筛查，并对风险因素提前进行预防和控制，从而提高RSA患者的妊娠成功率。

同时本研究显示IL-4 rs2243250 基因多态性与RSA发病不相关，目前国内关于IL-4 rs2243250多态性与RSA 相关性的文章尚未见报道，国外ESKANDAR团队运用等位基因特异性寡核苷酸杂交法PCR（ASO-PCR）技术行基因分型，分析伊朗妇女人群IL-4 rs2243250多态性与RSA发病的相关性，结果显示IL-4 rs2243250多态性与RSA 不相关［5］，与本研究一致。另外PARVEEN 等［6］运用同样的ASO-PCR 技术对北印度妇女人群IL-4 rs2243250 多态性位点进行检测分析，结果却发现在显性和等位基因模式下差异有统计学意义，T 等位基因和TT、TC 基因型是发生RSA 的危险因素。国外这两个研究采用同种检测技术进行基因分型，结果的差异可能主要由纳入的人群种族不同所造成。

关于IL-4R rs1805010 基因多态性的研究，近年来主要集中在过敏性相关疾病，如哮喘和肾移植后急性排斥反应等，也见于宫颈上皮内病变与宫颈癌［14-16］，但关于IL-4R rs1805010 基因多态性和RSA的相关性目前尚未见报道。本项目首次对IL-4R rs1805010 基因多态性和RSA 的相关性研究显示，A等位基因和AA、GA 基因可能是发生RSA 的保护因素，临床应重点关注携带IL-4R rs1805010 位点G 等位基因和GG 基因型的妇女，其RSA 发病风险相对增高。关于IL-4R rs1805010 基因多态性与RSA 的发病机制目前尚不清楚，IL-4R 是一种由两个不同亚基组成的蛋白质，即α链和γc 链。α链从IL-4 信号转移而来，随后被γc 链放大［17］。IL-4R rs1805010基因多态性位于α链的编码区，研究表明，这种多态性变异可影响IL-4R 受体对IL-4 的敏感性增强，这种增强的IL-4 信号持续促进磷酸化，会使STAT6转录因子异常激活，导致Th2 细胞分化增加［18-19］。Th1/Th2 分化失衡可能会导致细胞因子分泌异常，进而在RSA的发生发展中发挥重要作用。

本研究显示环境因素居住地和家庭月收入是RSA 的风险因素，IL-4R rs1805010 位点A 等位基因和AA、GA 基因型可能是RSA 发病的保护因素，IL-4 rs2243250 基因多态性与RSA 无相关性。IL-4 及其受体IL-4R 与RSA 相互作用机制及环境因素和基因的交互作用还有待进一步研究。