CCL15在脓毒症免疫病理过程中的作用及机制研究①

黄丽莉 李佳熹 黄 俊 余仁琳 曹 炬（重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆 400016）

根据脓毒症3.0 的定义，脓毒症是由于宿主对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍［1］。脓毒症对人们的生命健康造成极大威胁，虽然近年来脓毒症在诊断及治疗方面都取得了明显进展，但迄今为止，它仍是ICU死亡的主要原因。当脓毒症伴随休克发生时，病死率可以达到40%～50%［2］。脓毒症发病机制尚未明了，且无较好治疗方案和诊断标志物［3］。脓毒症主要由机体免疫功能紊乱所致，在此过程中有大量细胞因子参与，促炎因子大量释放的同时伴有抑炎因子的合成与释放，与后期发展成免疫失衡密切相关［4］。因此，探寻细胞因子在脓毒症中的调控作用有助于明确脓毒症发生机制。CCL15（CC motif chemokine ligand 15）是一种重要的趋化因子，通过与CCR1和CCR3结合对免疫细胞发挥生物学活性，它对大多外周血白细胞亚群都有强吸引力［5］。有研究报道CCL15参与慢性肺炎、结直肠癌的疾病进程，体现了CCL15 在癌症转移和炎症反应中的作用，但关于CCL15 在脓毒症中的作用尚不清楚［6-7］。本研究发现CCL15 在脓毒症患者中的表达水平显著升高，表明CCL15 参与脓毒症的疾病进程，进一步探究其参与脓毒症免疫调控的机制，有望为脓毒症的诊治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用6～8 周雄性C57BL/6 小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（合格证号：110322220100267963），饲养于重庆医科大学SPF 级实验动物中心，所有动物实验操作严格遵守动物中心的要求，并经重庆医科大学伦理委员会论证通过。

1.1.2 实验材料、试剂 根据脓毒症3.0 的定义，纳入重庆医科大学第一附属医院的30 例脓毒症成人患者以及重庆医科大学第一附属医院体检中心收治30 例年龄和性别匹配的健康成人对照样本。记录患者及健康对照者的临床资料，包括序贯器官衰竭评估（SOFA）评分、白细胞（WBC）计数、降钙素原（PCT）、C 反应蛋白（CRP）、血小板（PLT）水平、年龄等（表1）。恶性肿瘤患者、器官移植患者、艾滋病毒感染者和在过去8周内接受免疫抑制治疗的患者被排除在研究之外。本方案经重庆医科大学临床研究伦理委员会批准。

表1 脓毒症患者及健康对照者临床资料Tab.1 Baseline characteristics of patients with sepsis and healthy controls

哥伦比亚血琼脂平板购自安图生物；ELISA 试剂盒购自Sigma 公司，人重组CCL15 蛋白（recombinant human CCL15 protein）购自R&D Systems；Alexa 647 标记的CD11b 抗体、PE 标记的F4/80 抗体及同型对照抗体购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立与分组 将小鼠随机分为3 组，每组10 只，即假手术组（Sham）、对照组（CLP+PBS）、蛋白组（CLP+CCL15）。采用盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）模型建立脓毒症的动物模型［8］。在CLP 模型中，通过对小鼠进行盲肠结扎穿刺，造成内源性腹部感染，随后细菌进入血液腔室，引发全身炎症反应。麻醉小鼠并暴露盲肠，用缝合线进行结扎，再用穿刺针刺穿盲肠，随后对腹部切口进行缝合。Sham 组小鼠接受麻醉，暴露盲肠，但不进行结扎或穿刺，随后将盲肠放回腹膜腔。在补充重组蛋白时，小鼠CLP 术后立即注射人CCL15重组蛋白，对照组小鼠进行同样操作，并注射等量含0.1%BSA的PBS。

1.2.2 ELISA 检测血清CCL15 水平 取脓毒症患者、健康体检者外周血，离心后取血清冻存于-80℃冰箱中。取脓毒症小鼠或对照组小鼠心脏血，离心后取血清冻存于-80℃。实验步骤严格按照ELISA试剂说明书进行。

1.2.3 血液生化 心脏穿刺后用肝素抗凝EP管收集小鼠血液，离心后取上清。检测丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、和肌酐（CREA）等指标。

1.2.4 细菌载量试验 在CLP 后的24 h 处理小鼠，在无菌条件下收集心脏血。梯度稀释10 倍及100 倍，无菌涂布于血琼脂平板，37℃孵育过夜，计菌落数量。

1.2.5 组织病理 取小鼠肺脏、肝脏，浸泡于4%多聚甲醛中，4℃固定24～48 h。之后依次进行洗涤、脱水、透明、浸蜡，然后进行包埋和切片。将石蜡切片于二甲苯中脱蜡，于梯度浓度的乙醇中进行水化。苏木精染色后，用自来水冲洗后在1%盐酸乙醇中分化10 s。在饱和碳酸锂溶液中处理后在蒸馏水中静置数分钟，用伊红染色2 min。漂洗后用梯度乙醇脱水2 min，转移入二甲苯中透明处理10 min，最后用中性树胶封片，于显微镜下观察。

1.2.6 腹腔灌洗液（peritoneal lavage fluide，PLF）总白细胞计数 取小鼠PLF，4℃离心后弃上清。加入500µl红细胞裂解液重悬细胞沉淀，裂解3 min后再次离心弃去上清。加入1 ml PBS 再次重悬细胞沉淀，用牛鲍计数板计数总白细胞数，剩余细胞可用于流式检测。

1.2.7 流式抗体染色 取PLF 细胞沉淀加入红细胞裂解液裂解3 min，离心后去上清。用已预冷处理的无菌PBS 洗涤2 次。向每管内加入2 µl CD16/32抗体，充分混匀后转移至4℃冰箱内，避光封闭15 min。分别向EP 管内加入1µl 待染色细胞的特异性荧光标记抗体（Alexa 647-CD11b、PE-F4/80）或者其同型对照抗体，4℃避光孵育30 min。用PBS洗涤细胞后进行离心重悬，送检。

1.2.8 细菌吞噬和杀伤试验 小鼠腹腔注射液体石蜡，以募集巨噬细胞。5～7 d 后将小鼠断颈，于无菌环境下抽取腹腔灌洗液，获得原代腹腔巨噬细胞，待细胞稳定之后分别加入蛋白或者PBS 刺激过夜。以MOI 100 加入铜绿假单胞菌在37℃下感染巨噬细胞30 min，用含有妥布霉素的缓冲液去除胞外细菌。加入200µl 无菌双蒸水，室温裂解细胞约20 min以评估吞噬能力（t=0 h），或孵育2 h（t=2 h）以评估细菌杀伤能力。将稀释后的裂解液均匀铺于血平板，置于37℃孵箱内培养16～20 h，计数菌落数量。

1.3 统计学处理 所有数据的统计分析和作图均使用GraphPad Prism 5.01 软件进行。采用Mann-WhitneyU检验分析组间差异；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线并采用对数秩检验进行生存曲线分析，比较生存率差异。P＜0.05 表示差异有统计学意义。所有实验均重复2次。

2 结果

2.1 CCL15 在脓毒症患者和脓毒症小鼠中表达升高 ELISA 检测脓毒症患者和健康体检者血清CCL15 的含量，脓毒患者血清中CCL15 表达明显高于健康对照组（P＜0.000 1，图1A）。随后血清浓度下降，但仍然显著高于对照组（P＜0.000 1，图1B）。通过CLP 建立小鼠脓毒症模型，取小鼠心脏血，ELISA 检测CCL15 水平。结果显示，脓毒症小鼠CCL15水平较Sham组小鼠显著升高（P＜0.01，图1C）。

图1 脓毒症患者和脓毒症小鼠ELISA检测结果Fig.1 ELISA results of septic patients and septic mice

2.2 CCL15 显著改善脓毒症小鼠生存率 在实验动物模型中，通过注射人CCL15 重组蛋白，进一步探究CCL15 在脓毒症中的作用。其中，实验组和CLP+PBS 组小鼠均通过CLP 方法构建脓毒症的动物模型，并分别注射CCL15 重组蛋白（0.5µg/只）和含0.1%BSA 的PBS。Sham 组对小鼠进行腹腔的剪开、缝合。在建模后14 d 内每天观察小鼠的生存情况。观察发现，在补充CCL15 重组蛋白之后，脓毒症小鼠的生存率较CLP+PBS 显著提高（P＜0.01，图2）。结果表明，CCL15可以改善脓毒症生存率。

图2 补充重组CCL15蛋白改善脓毒症小鼠生存率Fig.2 Supplementation with recombinant CCL15 protein improved survival rate of sepsis mice

2.3 CCL15 改善脓毒症小鼠病理损伤 脓毒症往往导致多器官损伤，进一步研究了CCL15 对于脓毒症小鼠器官损伤的影响。生化结果显示，蛋白处理组ALT、LDH、CREA 等生化损伤相关指标较PBS 处理组显著降低（P＜0.05，图3）。HE 染色也显示CCL15处理改善了脓毒症小鼠的器官损伤情况。对照组小鼠的肝组织中局部可见较大量的肝细胞坏死，核碎裂或溶解，局部可见肝细胞水肿（图4A）；肺组织中较多肺泡壁增厚，伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润（图4B）。CCL15 处理组的炎症浸润、充血水肿均有改善。

图3 CCL15对脓毒症小鼠生化指标的影响Fig.3 Effects of CCL15 on biochemical indexes of septic mice

图4 CCL15 对脓毒症诱导的小鼠组织病理学改变的影响（×200）Fig.4 Effects of CCL15 to histopathological changes in septic mice（×200）

2.4 CCL15 处理促进脓毒症小鼠细菌清除 脓毒症与感染密切相关，为进一步探索CCL15 对于脓毒症小鼠体内细菌清除的影响，于CLP 术后24 h 取小鼠心脏血进行细菌载量实验。相较于CLP+PBS 组，CLP+CCL15 组的小鼠血液中的细菌载量显著降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01，图5）。

图5 细菌载量Fig.5 Bacterial counts

2.5 CCL15处理促进小鼠PLF免疫细胞聚集 CLP建模后24 h 的脓毒症小鼠腹腔灌洗液，计细胞总数，通过流式细胞术染色计数巨噬细胞（CD11b+F4/80+）百分比。经重组CCL15 蛋白处理后，脓毒症小鼠PLF 中白细胞总数较PBS 处理的CLP+PBS 组显著增加（P＜0.05，图6），提示白细胞募集显著增多。相较于CLP+PBS 组，CLP+CCL15 组小鼠PLF 中巨噬细胞比例增加，巨噬细胞数量显著增多（P＜0.05，图6）。

图6 CLP术后小鼠PLF中白细胞浸润情况Fig.6 Leukocytes recruitment in PLF after CLP

2.6 CCL15 处理对巨噬细胞吞噬杀伤的影响 进一步通过体外实验探究CCL15 是否影响巨噬细胞抗菌功能。分别用重组人CCL15蛋白和PBS刺激巨噬细胞，再用铜绿假单胞菌感染巨噬细胞，结果显示，经CCL15 蛋白刺激后，巨噬细胞的吞噬杀伤能力高于PBS 对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05，图7）。

图7 CCL15对巨噬细胞杀伤的影响Fig.7 Effects of CCL15 on bacterial phagocytosis and killing by macrophages

3 讨论

脓毒症在任何年龄、任何基础疾病背景下均可发生，尤其是在并发脓毒症休克后更加危险，病死率极高［9］。有研究报道，脓毒症是重型及危重型新冠肺炎患者最常见的并发症，重症患者多在1 周后出现脓毒症、脓毒性休克，脓毒症在新冠肺炎非幸存组的发生率甚至达到100%［10-11］。脓毒症目前仍缺乏有效的治疗药物和高效诊断标志物，对于脓毒症的认识还需要更多的研究。CCL15 又名Lkn-1、HCC-2、NCC-3，其mRNA在肝、肠、肺中高度表达［12-13］。本研究首次阐明CCL15 在脓毒症中表达量显著增高，发挥免疫保护作用，改善脓毒症小鼠生存情况。

过去的研究显示，CCL15 表达在慢性过敏性肺炎、哮喘、肝癌等疾病中升高，体现了CCL15 在癌症转移和炎症反应中的作用［6，14-15］。通过ELISA 检测发现，脓毒症患者和脓毒症小鼠的CCL15 含量同样显著升高，提示CCL15 参与脓毒症免疫病理，且对脓毒症诊断具有潜在价值。鉴于CCL15 表达水平在脓毒症患者和脓毒症小鼠中均显著升高，为了进一步验证CCL15 在脓毒症中发挥的作用，通过给小鼠注射补充人CCL15 重组蛋白，评价其对生存率的影响。有研究表明C-X-C 亚族（α 亚族）趋化因子受体抑制可在一定时间范围内提高脓毒症患者的生存率，体现了α 趋化因子在脓毒症中的潜在免疫损害作用［16］。CCL15 作为β 亚族趋化因子的成员，本研究中通过注射CCL15 的重组蛋白，却显著提高了脓毒症小鼠的生存率。进一步，在实验性脓毒症中发现，注射CCL15 蛋白可以改善小鼠器官损伤，促进细菌清除，从而发挥保护作用并提高脓毒症小鼠的生存率。吞噬细胞是脓毒症发生发展过程中的关键细胞，在感染控制中发挥重要作用。有研究表明，IL-34在脓毒症期间可以通过调控巨噬细胞的募集来改善生存率［17］。颗粒蛋白前体（progranulin）通过促进腹腔巨噬细胞的募集在脓毒症中发挥保护作用［18］。这与本研究的结果一致，CCL15 可以促进脓毒症小鼠PLF 中的巨噬细胞聚集，它在脓毒症中的免疫保护作用可能是通过巨噬细胞来介导的。CCL15 在人骨肉瘤细胞中可以激活NF-κB，而NFκB 是调节激活巨噬细胞的关键转录因子［19-21］。也有研究表明，长链非编码RNA NEAT1 调控NF-κB通路，在脓毒症诱导的急性肾损伤中发挥重要作用［22］。通过体外实验发现，CCL15 蛋白处理可以在一定程度上促进巨噬细胞对细菌的吞噬杀伤，但没有显著差异。综上所述，尽管对巨噬细胞的吞噬杀伤能力影响不大，CCL15 可通过显著增加吞噬细胞数量来促进细菌清除。关于CCL15 在脓毒症中如何参与疾病进程，其更加深入的分子机制需更进一步的研究。

综上所述，CCL15 在脓毒症中发挥免疫保护作用，通过促进巨噬细胞聚集，促进细菌清除，改善病理损伤，改善脓毒症小鼠生存率。以上结果为进一步探究脓毒症的发病机制和治疗方法奠定了基础。