miR-103a-3p靶向PTEN基因促进血管瘤内皮细胞增殖、迁移及侵袭

陈 君 李 娜 叶 筠 王默然 朱寒珏（华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院，武汉市妇女儿童医疗保健中心整形颌面外科，武汉 430000）

血管瘤是一种发生在皮肤血管上的良性肿瘤，多见于婴幼儿时期。目前，血管瘤的发病机制尚不明确，通常认为与血管瘤内皮细胞（hemangioma endothelial cells，HemEC）的过度增殖、迁移和侵袭密切相关［2］。因此，探究HemEC 增殖、迁移和侵袭的机制可为血管瘤的治疗提供新靶点。微RNA（microRNA，miRNAs）是长度为18～25个核苷酸的内源性短链非编码RNA，其可与靶基因的3'-UTR 结合，抑制靶mRNA 翻译或降解靶mRNA，从而调节基因的表达，参与细胞增殖、分化和凋亡等过程，在人类多种疾病尤其是肿瘤的发生和发展中起重要作用［3-5］。研究显示，miR-103a-3p 在口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表达升高，作为促癌基因参与肿瘤的发生发展［6-7］。但目前miR-103a-3p 在血管瘤中的表达及其对血管瘤细胞恶性生物学行为的影响和分子机制还未知。生物信息学软件预测显示，miR-103a-3p 与第10 号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）的3'-UTR 存在连续的结合位点，提示PTEN可能是miR-103a-3p的靶基因。研究显示，PTEN 在血管瘤中表达降低，靶向上调其表达可抑制血管瘤细胞增殖和集落形成，并阻滞细胞周期进程［8］。本研究以HemEC 为研究对象，旨在探究miR-103a-3p 对HemEC 增殖、迁移和侵袭的影响及其能否靶向调控PTEN 发挥作用，以期为血管瘤的靶向分子治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 选取华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院2017 年5 月至2019 年3 月收治的23例血管瘤患儿的瘤组织和瘤旁正常皮肤组织，其中男14 例，女9 例，年龄2～15 个月，平均年龄（7.26±4.16）个月。所有瘤组织标本经病理诊断确诊。纳入标准：患儿初次确诊；术前未进行任何治疗。排除标准：合并其他肿瘤；接受激光、药物注射等治疗。本研究经华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院医学伦理委员会批准同意，患儿家属自愿签署知情同意书。

1.1.2 细胞与试剂 HemEC、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）均购自美国模式培养物保存中心（ATCC）；细胞培养基（DMEM）购自北京康为世纪公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；噻唑蓝（MTT）购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000 购自北京宜科思源科技有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司；迁移实验（Transwell）小室购自美国Corning 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自德国罗氏公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒购自上海碧云天生物公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司；兔抗人PTEN和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HemEC 和HUVEC 细胞复苏后，均用含15% FBS 的DMEM 完全培养基置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。每隔1～2 d更换1次培养基，当细胞生长密度达80%左右时，吸弃培养基，0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例进行传代培养。

1.2.2 细胞转染 HemEC 以1×105个/孔接种于6 孔板，当细胞生长密度达60%左右时，更换为不含FBS 的培养基。将HemEC 随机分为anti-miR-130b-3p 组（转染miR-130b-3p 抑制剂）、anti-miR-NC组（转染抑制剂阴性序列）、pcDNA 组（转染空载体）、pcDNA-PTEN 组（转染PTEN 过表达载体）、antimiR-130b-3p+si-con 组（共转染anti-miR-130b-3p 抑制剂和小干扰RNA 阴性序列）和anti-miR-130b-3p+si-PTEN组（共转染anti-miR-130b-3p抑制剂和PTEN小干扰RNA），具体转染操作参照LipofectamineTM2000 试剂盒，转染时间为6 h。然后更换为含15%FBS 的培养基，再培养24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 RT-qPCR 检测组织细胞中miR-103a-3p 和PTEN mRNA 表达 RNA 抽提试剂盒提取组织或细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度后，参照反转录试剂盒将其合成为cDNA。然后以cDNA为模板，进行RT-qPCR 扩增。PCR 扩增条件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35 个循环。miR-103a-3p 正向引物：5′-AATTCAAAAAAGCAGCATTGTACAGGGCTATGA-3′，反向引物：5′-CCGGTCATAGCCCTGTACAATGCTGCTTTTTTG-3′；PTEN正向引物：5′-CAATGACAGCCATCATCAAAGAG-3′，反向引物：5′-GCTCAGACTTTTGTAATTTGTG-3′；GAPDH 正向引物：5′-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3′，反向引物：5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-103a-3p 以U6 为内参，PTEN 以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算miR-103a-3p和PTEN mRNA的相对表达。

1.2.4 MTT 检测细胞活力 转染后的各组HemEC细胞以4×104个/孔接种于96 孔板，每组设置3 个复孔。培养箱中分别培养24 h、48 h 和72 h 后，加入20µl MTT 溶液（5 g/L）。继续孵育4 h，吸弃培养基，加入150µl二甲基亚砜，振荡混匀后，酶标仪490 nm波长下检测细胞光密度值（OD）。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 转染后的各组HemEC 细胞用不含FBS 的培养基调整浓度为1×105个/ml 细胞悬液。迁移实验：Transwell 小室置于24 孔板中，上室加入200 µl 细胞悬液，下室加入600µl 的15%FBS 培养基。培养箱中培养48 h 后，吸弃培养基，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min。显微镜下观察，随机选取5 个视野，拍照并对迁移细胞计数。侵袭实验：Matrigel 基质胶4℃融化后，用不含FBS的培养基以1∶8比例进行稀释。然后铺于Transwell上室，自然干燥后，加入200µl细胞悬液，后续操作与迁移实验相同。

1.2.6 Western blot 实验检测细胞中PTEN 蛋白水平 转染后的各组HemEC 细胞以2.5×105个/孔接种于24 孔板，每组设置3 个复孔。培养箱中培养24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。RIPA 试剂提取细胞中总蛋白，BCA 蛋白试剂盒检测蛋白含量。取适量蛋白溶液，加入1×上样缓冲液，混合均匀，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，行10% SDSPAGE 电泳。电泳结束后，将分离蛋白湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1.5 h。加入PTEN 抗体（1∶1 000），4℃过夜孵育。加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h。加入化学发光试剂，避光显影后，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测实验 PCR 技术扩增含miR-103a-3p 结合位点的PTEN-3'UTR 序列，克隆至psiCHECK2 双荧光素酶报告载体，构建PTEN 野生型（WT-PTEN）质粒。同时利用基因定点突变技术将结合位点突变后，克隆至psiCHECK2 双荧光素酶报告载体，构建PTEN 突变型（MUT-PTEN）质粒。HemEC 以1×105个/孔接种于6 孔板，当细胞生长密度达60%时，参照LipofectamineTM2000 试剂盒操作说明书，分别将WT-PTEN 与miR-NC 或miR-103a-3p mimics、MUT-PTEN 与miR-NC 或miR-103a-3p mimics 共转染至细胞，具体转染操作同1.2.2。转染6 h后，更换为含15%FBS 的培养基。继续培养至48 h，收集细胞，参照荧光素酶活性检测试剂盒检测各组的荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件分析实验数据。符合正态分布的计量资料用表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-103a-3p、PTEN在血管瘤组织中的表达如图1 所示，与正常皮肤组织比较，血管瘤组织中miR-103a-3p 表达水平显著升高（P＜0.05），PTEN 的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

图1 miR-103a-3p和PTEN在血管瘤组织中的表达Fig.1 Expressions of miR-103a-3p and PTEN in hemangiomas tissue

2.2 miR-103a-3p、PTEN 在HemEC 和HUVEC 中的表达 如图2 所示，与HUVEC 细胞比较，HemEC 细胞中miR-103a-3p 表达显著升高（P＜0.05），PTEN 的mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。

图2 miR-103a-3p和PTEN在HemEC和HUVEC中的表达Fig.2 Expressions of miR-103a-3p and PTEN in HemEC and HUVEC

2.3 抑制miR-103a-3p 表达对HemEC 增殖的影响如图3 所示，anti-miR-103a-3p 组HemEC 中miR-103a-3p 表达水平显著低于anti-miR-NC 组（P＜0.05），表明anti-miR-103a-3p 转染成功，细胞中miR-103a-3p 表达受到抑制。与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-103a-3p 组HemEC 在48 h、72 h 时细胞OD值均显著降低（P＜0.05）。

图3 抑制miR-103a-3p表达对HemEC增殖的影响Fig.3 Effects of inhibiting miR-103a-3p on HemEC prolife-ration

2.4 抑制miR-103a-3p 表达对HemEC 迁移和侵袭的影响 如图4 所示，与anti-miR-NC 组比较，antimiR-103a-3p 组HemEC 的迁移和侵袭数均显著降低（P＜0.05）。

图4 抑制miR-103a-3p表达对HemEC迁移和侵袭的影响Fig.4 Effects of inhibiting miR-103a-3p on HemEC migra

2.5 过表达PTEN 对HemEC 增殖、迁移和侵袭的影响 如图5所示，pcDNA-PTEN组HemEC中PTEN蛋白表达显著高于pcDNA 组（P＜0.05），表 明pcDNA-PTEN 转染成功，细胞中PTEN 过表达。与pcDNA 组比较，pcDNA-PTEN 组HemEC 在48 h、72 h时细胞OD 值显著降低（P＜0.05），迁移和侵袭数显著降低（P＜0.05）。

图5 过表达PTEN对HemEC增殖、迁移和侵袭的影响Fig.5 Effects of over-expressing PTEN on HemEC proliferation，migration and invasion

2.6 miR-103a-3p靶向调控PTEN的表达 miRcode在线预测网站显示，miR-103a-3p与PTEN3'UTR存在互补的核苷酸序列（图6A）。miR-103a-3p 可降低WT-PTEN 的荧光素酶活性（P＜0.05），而对MUTPTEN 的荧光素酶活性无显著影响（P＞0.05，图6B）。miR-103a-3p 组PTEN 蛋白水平低于miR-NC 组（P＜0.05），anti-miR-103a-3p组PTEN 蛋白水平高于antimiR-NC组（P＜0.05，图6C、D）。

图6 miR-103a-3p靶向PTENFig.6 miR-103a-3p targets PTEN

2.7 敲减PTEN 表达逆转抑制miR-103a-3p 对HemEC 增殖、迁移和侵袭的影响 如图7 所示，与anti-miR-103a-3p+si-NC 组比较，anti-miR-103a-3p+si-PTEN 组HemEC 在48 h 和72 h 时的OD 值显著升高（P＜0.05），迁移和侵袭数均显著升高（P＜0.05）。

图7 敲减PTEN 逆转抑制miR-103a-3p对HemEC 增殖、迁移和侵袭的影响Fig.7 Knockdown of PTEN reversed effect of miR-103a-3p on HemEC proliferation，migration and invasion

3 讨论

血管瘤是婴幼儿时期常见的肿瘤之一,部分血管瘤无需进行治疗可自行消退，另有少部分血管瘤呈现持续性增长，严重时可引发毁容及局部组织器官功能障碍［9-10］。研究表明，miRNAs 在血管瘤的发生发展中起重要作用，探究影响血管瘤内皮细胞生物学行为的miRNAs 及其作用机制，可为血管瘤的治疗提供新靶点［11-13］。miR-103a-3p 是近年来新发现的一种miRNA，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等恶性生物学行为，与肿瘤的发生发展密切相关。如HU 等［14］研究显示，miR-103a-3p 在胃癌组织中表达升高，抑制其表达通过负调控ATF7抑制胃癌细胞增殖，并阻滞细胞周期进程，在胃癌中作为促癌基因发挥作用；SUN等［15］研究显示，miR-103a-3p 在结肠癌组织和细胞系中高表达，而且miR-103a-3p 表达与患者预后呈负相关，上调miR-103a-3p 可促进缺氧条件下结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解；ZHANG 等［16］研究显示，miR-103a-3p在甲状腺癌组织中和细胞系中的表达增加，通过靶向抑制LATS1 的表达促进甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，miR-103a-3p/LATS1 轴为甲状腺癌治疗提供了新靶点。但目前，miR-103a-3p在血管瘤中的表达及对血管瘤细胞恶性生物学行为的影响和分子机制尚未可知。

本研究显示，miR-103a-3p 在血管瘤组织和HemEC 中均呈高表达，抑制其表达可降低HemEC的增殖、迁移和侵袭，提示miR-103a-3p 作为促癌基因参与血管瘤发生发展，其可作为血管瘤的分子治疗靶点。本研究利用双荧光素酶报告基因实验验证了miR-103a-3p 与PTEN 的靶向关系，并检测了miR-103a-3p对HemEC中PTEN蛋白表达的影响，结果显示，PTEN 是miR-103a-3p 的靶基因，且miR-103a-3p负调控PTEN。

PTEN 是具有脂质磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因，可调节基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等影响肿瘤血管的生成，从而抑制肿瘤的生长和转移［17］。研究显示，PTEN 的过表达可通过线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡［18］；miR-4310 通过靶向抑制PTEN 并激活PI3K/AKT 途径促进神经胶质瘤的发展［19］；miR-301a-3p在食管癌中表达升高，其靶向抑制PTEN 蛋白表达促进食管癌细胞的增殖力［20］。王川等［21］研究显示，婴幼儿血管瘤组织和细胞中PTEN 表达显著降低，过表达PTEN 可通过下调VEGF、抑制VEGFR-2 的磷酸化来降低HemEC 的增殖能力，并促进HemEC 凋亡。LI 等［22］发现，普萘洛尔可通过靶向miR-382 上调血管瘤细胞中PTEN 表达、抑制AKT/mTOR 信号通路来降低血管瘤内皮细胞的增殖和迁移并诱导细胞凋亡。这些结果与本研究过表达PTEN 可抑制HemEC 增殖、迁移和侵袭的结果一致。本研究还显示，敲减PTEN逆转了抑制miR-103a-3p对HemEC增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步证明抑制miR-103a-3p可以通过上调PTEN抑制血管瘤的发生发展。

综上所述，miR-103a-3p在血管瘤组织和血管瘤内皮细胞中呈高表达，抑制miR-103a-3p 可降低血管瘤内皮细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与靶向负调控PTEN 有关，miR-103a-3p/PTEN 轴可能为血管瘤的靶向治疗提供新靶点。