甲基营养型芽孢杆菌Z21发酵条件优化及抑菌活性分析

江丹霞，武少兰，杨国辉，詹艺舒，罗小芳，周天峰，刘培培，杨成龙 ，江玉姬,3

（1. 福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2. 福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州350001；3. 福建农林大学生命科学学院菌物研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】真菌污染是导致食品质量安全问题和农作物减产的重要原因之一，每年由真菌污染导致的食品腐败占30%以上[1-2]。食品中常见污染真菌有木霉属、青霉属、镰刀属、曲霉属等[3-4]，它们具有数量多、分布广、生长速度快、生长环境不苛刻等特点，产毒能力极强且难以降解[5-6]，因此食品霉变不仅会造成营养损失、经济损失，还严重威胁着人们的身体健康。【前人研究进展】食品防腐剂主要有化学合成防腐剂和天然防腐剂，由于合成的食品防腐剂安全性较低[7]，所以天然食品防腐剂的开发成为研究的热点。天然食品防腐剂近年来逐渐从植物源、动物源转向微生物源，其中芽孢杆菌属细菌具有安全性高、易于规模化发酵、生产成本低等突出优势，且产生的活性物质具有高效、无毒和安全等特点[8-10]，已广泛应用于环境保护、植物保护、食品防腐等各个行业，有巨大的发展潜力和广阔的市场[11-13]。许多研究表明芽孢杆菌在食品中的防霉防腐作用效果显著，可以明显延长食品的保藏期[14-16]。芽孢杆菌抗菌的作用机制主要是产生3类拮抗物质：蛋白类物质、脂肽类物质和其他类代谢物质[17-19]。甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）是2010年Munusamy等[20]首次从韩国传统种植的水稻根际土壤中分离得到一株新的芽孢杆菌，对人、畜及环境安全无害，可产生多种抑菌活性物质[21-22]。张可可等[23]研究表明甲基营养型芽孢杆菌SX09产生的胞外抑菌物质对5株食源性致病菌和3株食品腐败霉菌都有抑菌作用。吴燕燕等[24]发现甲基营养型芽孢杆菌抗菌肽对罗非鱼片有良好的防腐保鲜效果，可将冷藏保质期延长4 d以上。尹向田等[25]发现甲基营养型芽孢杆菌GSBM 05的次级代谢物可拮抗葡萄白腐病病菌。魏新燕等[26]研究表明甲基营养型芽孢杆菌BH21脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用。【本研究切入点】前期研究发现Z21菌发酵液对黑曲霉、康氏木霉等真菌有抑制作用[27]，且甲基营养型芽孢杆菌具有安全性高、易发酵、生产成本低等突出优势，其代谢产物可开发为食品的天然防腐剂或天然保鲜剂，然而其发酵条件及抑菌活性有待深入探讨。【拟解决的关键问题】本研究基于从空气中分离出的一株拮抗真菌的甲基营养型芽孢杆菌Z21，在前期完成其培养基优化的基础上，进一步研究其产活性物质的发酵条件，抑菌活性物质的稳定性，为开发食品的天然防腐剂或天然保鲜剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

指示菌为康氏木霉（Trichoderma koningii），由福建农林大学食品科学学院基础实验室保藏。甲基营养型芽孢杆菌Z21（Bacillus methylotrophicusZ21）由本课题组分离得到。

1.2 主要试剂及仪器

琼脂（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、NH4NO3、MgSO4、BaCl2、KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2、(NH4)2SO4（均 为 分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；透析袋：分子截留量为8～14 kD，Sigma公司。

SHP-250恒温摇床、SPX-250恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司产品；ME204E电子天平、FE28 pH计：梅特勒-托利多国际股份有限公司产品；H-1850R高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；UV-1700紫外分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司产品；LX-B35L灭菌锅：合肥华泰医疗有限公司产品；VS-1300L-U洁净工作台：苏净集团安泰空气技术有限公司产品。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）、改良马铃薯液体培养基（KPDL），配方及具体配制参考詹艺舒等[27]的方法。

1.4 种子液的制备

300 mL锥形瓶装入100 mL KPDL液体培养基，灭菌后，用无菌接种环挑取一环Z21菌接入液体培养基，30 ℃，140 r·min-1恒温震荡培养18 h，制备含量在105～106CFU· mL-1的种子液。

1.5 无菌发酵液的制备

将种子液接种于液体KPDL培养基，恒温震荡培养。培养液4 ℃，4 500 r·min-1离心20 min，收集上清液过0.22 μm的无菌滤膜，收集滤液即无菌发酵液。

1.6 Z21无菌发酵液抑菌效果

参考李恩琛等[28]的牛津杯法并略做修改：制备PDA培养基平板，在距离平板中央25 mm处放置牛津杯，并加入150 μL的无菌发酵液，以加入等体积的液体培养基为空白对照，然后在平板中央接种直径为8 mm的康氏木霉菌块，于28 ℃培养4 d后，用游标卡尺十字交叉法测量指示木霉菌的菌丝生长直径，检测抑菌效果。试验设3个重复，计算平均值。

抑制率/%=[（对照组霉菌菌落直径-处理组霉菌菌落直径）/（对照组霉菌菌落直径-菌块直径）]×100。

1.7 单因素发酵试验

于500 mL锥形瓶中分别添加50、100、150、200、250 mL KPDL培养基；接种量试验设2%、3%、4%、6%、8%、10%种子液；温度试验设28、30、32、35、37 ℃；摇床震荡培养的转速为100、120、140、160、180、200 r·min-1；恒温震荡培养时间为36、48、60、72、84 h；培养液按1.5步骤制备无菌发酵液，以牛津杯法检测抑菌活性，抑制率为评价指标，设3次重复，计算平均值，优化发酵工艺条件。

1.8 正交试验

选择装液量（A）、接种量（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）和转速（E）为考察因素，采用5因素3水平L18（35）正交试验设计，以抑制率评价不同因素对发酵液抑菌效果的影响，正交试验因素与水平见表1。

表 1 正交试验的因素及水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.9 Z21菌抑菌活性物质稳定性检测

1.9.1 温度对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响取相同量的无菌发酵液分别置于40、60、80、100、120 ℃温度下作用 30 min，测定抑制率。

1.9.2 紫外线对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响取相同量的无菌发酵液分别置于紫外光灯（254 nm）下放置30、60、90、120、150、180、210 min，测定抑制率。

1.9.3 pH对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响 取相同量的无菌发酵液将其pH分别用10% HCl和10%NaOH调 节 为1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、12.0、14.0，在25 ℃下作用2 h后将pH调回原pH（8.02），测定抑制率。

1.9.4 时间对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响取相同量的无菌发酵液置于40 ℃下分别作用30、60、90、120、150、180、210 min，测定抑制率。

1.9.5 酶对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响 在相同量的无菌发酵液中分别加入质量浓度为1 mg·mL-1的胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶和复合蛋白酶，并调节至其最适pH，在各自适宜温度下孵育2 h后，于100 ℃下处理5 min灭活酶，将pH调回原pH，测定抑制率。

1.9.6 金属离子对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响在无菌发酵液中分别加入终浓度为20 mmol·L-1的KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2，与发酵液按2∶8的体积比混合，作用2 h，测定抑制率。

以上试验均采用牛津杯法检测抑菌活性，抑制率表示活性大小，未经处理的无菌发酵液为对照，试验设3个重复，计算平均值。

1.10 活性物质的MIC测定

参考徐润[29]硫酸铵沉淀法并略作修改，添加100%硫酸铵饱和溶液于无菌发酵液中使溶液的最终浓度为70%，4 ℃静置过夜，12 000 r·min-1离心20 min，收集沉淀，用0.02 r·min-1PBS（pH=7.2）将沉淀完全溶解，将溶解后的溶液移入透析袋内（分子截留量为8～14 kD），每隔3 h更换一次透析液，直到用1% BaCl2溶液滴定透析外液无沉淀生成，将透析液浓缩到30 mL，冷冻干燥得到粗提物。

MIC测定参考王青华等[30]的方法并略作修改，配制含有粗提物1 000、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、1.56 mg·mL-1的PDB培养基，在无菌的48孔培养板上分别加入含有不同浓度粗提物的PDB培养基0.2 mL，以纯PDB为对照，然后每孔加入0.05 mL 104CFU·mL-1的康氏木霉孢子悬液，放置28 ℃培养24～48 h，待对照组中长出可见菌丝即可观察。试验设3个重复，确定MIC的浓度。

1.11 Z21菌对康氏木霉菌丝生长影响的显微镜观察

参考文娜[31]的方法并略作修改，距平板中央左右各3 cm处划线接种一环具有抑菌活性的细菌，28 ℃培养24 h后，将8 mm康氏木霉菌块转接到PDA培养基中央，28 ℃培养4 d后，取靠近Z21菌一面、边缘有明显被抑制的康氏木霉菌丝，以无Z21菌的培养皿培养康氏木霉菌丝作为对照，送福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所进行扫描电镜观察。

1.12 木霉菌丝核酸和蛋白质的泄露试验

参考陶阳[32]的方法并略作修改，配制质量浓度为12.5、25、50 mg·mL-1Z21菌粗提物的PDB培养基9 mL，将康氏木霉接种于PDB培养基中，28 ℃，150 r·min-1震荡培养48 h，形成含有较多菌丝的菌球。对照组不加入粗提物。分别于培养0、1、3、6、9、12、24 h时取出一定量的培养液，4 ℃，4 500 r·min-1离心15 min取上清液，用分光光度计在260 nm（核酸）和280 nm（蛋白质）处测定吸光值的变化，试验设3个重复，计算平均值。

1.13 数据处理

将获得的试验数据用SPSS 19.0进行统计分析，Excel整理并制图。

2 结果与分析

2.1 不同单因素对Z21菌无菌发酵液抑菌活性的影响

不同发酵时间、装液量、接种量、发酵温度和摇床转速对Z21菌无菌发酵液抑菌活性的影响试验结果见图1。

由图1-A可知：发酵时间对Z21菌无菌发酵液抑菌活性有显著影响（P＜0.05）。抑制率随着发酵时间延长，呈先上升后下降的趋势，说明并不是发酵时间越长其抑制率越高，发酵前期抑制率过低，可能是细菌产生的代谢物较少；后期抑制率降低，可能是后期营养物质被耗尽，营养物质不够时，抑菌活性物质被分解[33]。当发酵时间为48 h时，抑制率最高，达到55.57%。所以选择发酵时间为48 h。

由图1-B可知：装液量对Z21菌无菌发酵液抑菌活性有显著影响（P＜0.05）。500 mL锥形瓶装液量为50～250 mL时，随着装液量的增加，抑制率先上升后下降。其中在装液量为150 mL时，无菌发酵液的抑制率最高为68.90%，所以选择装液量为150 mL。

由图1-C可知：接种量对Z21菌无菌发酵液抑菌活性有显著影响（P＜0.05）。抑制率随着接种量的增加呈现先增大后减小的趋势，当接种量过大时，培养液的营养物质可能消耗过快，影响细菌后续生长；当接种量过少时，菌数较少，产生的抑菌物质过少，抑制率不高[34]。当接种量为3%时，抑制率最高，为67.76%，所以选择接种量为3%。

由图1-D可知：发酵温度对Z21菌无菌发酵液抑菌活性也有显著影响（P＜0.05），随着温度的升高，其抑制率先上升后下降，在37 ℃时，抑制率最低，只有28.9%；而28 ℃、30 ℃和35 ℃的抑制率较接近，差异不明显，抑制率均为45%左右。当发酵温度为32 ℃时，抑制率最高，达到67.36%，所以选择发酵温度为32 ℃。

由图1-E可知：摇床转速对Z21菌无菌发酵液抑菌活性有显著影响（P＜0.05）。一般来说转速越高，氧气越充分，细菌生长越好，但试验中抑制率随着转速的增加呈现“先增大后减少”的趋势，其原因可能为当转速为100 r·min-1时，转速太低，氧气不充分，细菌生长不好，代谢物质较少。在转速为120 r·min-1时，氧气充分，细菌长势好，分泌的抑菌物质较多，其抑制率最高，为68.37%，而当转速为140～200 r·min-1抑制率下降，其原因可能为培养液的溶氧量已饱和，无法再增加，另一方面，细菌可能主要进行生长，较少分泌代谢产物，抑制率降低[35-36]，所以选择转速为120 r·min-1。

2.2 Z21菌发酵条件正交试验结果

由表2可知，影响甲基营养型芽孢杆菌Z21无菌发酵液抑菌活性的主次顺序为E＞D＞A＞B＞C，最佳摇床发酵条件为A2B2C3D1E2，该工艺与试验14一样，按照此工艺进行3组平行试验，得到抑制率均为72%左右，较稳定。结果表明，甲基营养型芽孢杆菌Z21优化后的发酵条件为500 mL锥形瓶中装液体培养基150 mL、接种量3%、发酵时间60 h、发酵温度30 ℃、转速140 r·min-1。由表3可知，转速对抑制率的影响显著（P＜0.05）。

2.3 Z21菌抑菌活性物质稳定性

不同温度、紫外线、pH、作用时间、酶和金属离子对Z21菌抑菌活性物质稳定性的影响试验结果见图2。

由图2-A可知，经40～60 ℃温度处理，Z21菌发酵液中抑菌活性物质热稳定性较强，抑制率维持在72%，较稳定；经80～100 ℃处理后，抑菌率略微下降，在65%左右，但抑制率仍在50%以上。而经120 ℃处理后的发酵液的抑制率急剧下降（P＜0.05），低至8.17%，几乎丧失。说明Z21菌发酵液中抑菌活性物质对于100 ℃以内的温度其结构较稳定，能耐受100 ℃高温，而在120 ℃后抑菌物质结构被破坏，几乎没有抑制率。

由图2-B可知，Z21菌发酵液在紫外环境下处理30～90 min，抑制率变化不大（P＞0.05），维持在75%左右，与未经紫外照射的CK组的抑制率没有显著性影响；经紫外环境下处理120～210 min，抑制率仍保持在72%左右，抑菌率保持较稳定，说明Z21菌抑菌活性物质具有紫外稳定性。

由图2-C可知，Z21菌发酵液在酸性条件下的抑制率较高，说明活性物质在酸性条件较碱性条件稳定。与pH=8（CK）时的发酵抑制率比较，Z21菌发酵液在pH＞8或pH＜8条件下抑菌率稍有下降，但抑菌率仍然较高，说明Z21菌抑菌活性物质在pH为1～14的环境较稳定，可以作为食品防腐剂在食品中广泛使用。

由图2-D可知，Z21菌发酵液在40 ℃水浴30 min时，其抑菌率与CK组相比无显著性差异（P＞0.05），水浴60～120 min，抑制率稍有变化，但均维持在72%左右，处理150～210 min后，抑制率下降至61%左右，总体维持在60%左右，说明Z21菌的抑菌活性物质在40 ℃环境下相对较稳定。

由图2-E可知，无菌发酵液经复合蛋白酶处理后，抑制率为67.68%，与CK组比较，下降了5%，而经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶处理后的抑制率比CK组低了10%，维持在60%左右，但均高于50%，仍具有较强的活性，说明Z21菌抑菌活性物质对这5种酶不敏感。

由图2-F可知，发酵液经KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2金属离子处理后，抑制率发生了变化，说明金属离子对其有影响。Zn2+、Cd2+、Ca2+处理组与CK组比较，抑制率下降了7%左右，而经K+、Na+、Mg2+处理后，抑制率降低了15%左右，变化明显（P＜0.05），说明其抗菌活性物质在一定程度受到了这些金属离子的胁迫，但总体抑制率均保持在56%以上，保持较高的抑菌活性。

2.4 活性物质的MIC

MIC（Minimum inhibitory concentration），是 指最低抑菌浓度，是测量抗菌物质抗菌活性大小的一个指标。经过最优方法提取得到的粗提物，其抑制康氏木霉孢子萌发的测定结果见表4。

将完全不生长菌丝的一孔判定为终点，该孔浓度即为MIC。从表4可以看出，当空白孔中康氏木霉菌丝生长时，粗提物浓度为25 mg·mL-1的孔，菌丝未生长，故粗提物的MIC为25 mg·mL-1。

表 2 Z21菌发酵条件正交试验结果Table 2 Orthogonal test results on Z21 fermentation conditions

表 3 正交试验结果方差分析Table 3 ANOVA analysis on orthogonal test results

2.5 Z21菌对康氏木霉菌丝生长影响的显微镜观察

Z21菌对康氏木霉菌丝表面显微特征的影响的扫描电镜图如图3所示。

从扫描电镜可以看出（图3）：对照组的康氏木霉的菌丝表面平整，菌丝体饱满，有许多孢子梗，说明菌丝生长状态良好。处理组中的康氏木霉菌丝表面明显皱缩，菌丝明显变细，有的菌丝断裂，视野中未发现孢子梗，说明菌丝的生长发育以及孢子梗的分化受到明显抑制。

图 2 Z21菌发酵液抑菌活性稳定性Fig. 2 Stability of antibacterial activity of Z21 fermentation broth

表 4 Z21菌发酵液粗提物抑制康氏木霉孢子萌发的MICTable 4 MIC of crude Z21 fermentation extract on T. koningii spore germination

2.6 Z21菌粗取物对木霉菌丝核酸和蛋白质的泄露情况

用25 mg·mL-1粗提物的PDB培养康氏木霉的菌丝，根据蛋白质和核酸具有紫外吸收的性质，利用比色法测定康氏木霉菌丝细胞外液体的蛋白质和核酸含量，以此探究是否有内容物质（主要是蛋白质和核酸）的泄露[33]。测定结果如图4和图5所示。

从图4和图5可以看出，与对照组相比，随着时间的延长，含有粗提物的培养液中的康氏木霉菌丝培养液在260 nm和280 nm处的紫外吸光值不断增加，分别从最开始的0.03和0.03增加到0.15和0.16，说明康氏木霉菌丝细胞内的蛋白质、氨基酸和核酸等物质泄露到了细胞外，导致培养液的260 nm和280 nm处吸光值增加。综上所述，推测该活性物质可能是蛋白类物质或者为脂肽类物质[37]，且作用于真菌的细胞膜，导致细胞膜透性有所改变，细胞内容物外流。

图 3 受Z21菌影响的康氏木霉菌丝表面扫描电镜图Fig. 3 SEM images of T. koningii hyphae surface as affected by Z21

图 4 Z21菌发酵液粗提物对康氏木霉菌丝细胞内蛋白质泄露的影响Fig. 4 Effect of crude Z21 fermentation broth extract on protein leakage of T. koningii hyphae

图 5 Z21菌发酵液粗提物对康氏木霉菌丝细胞内核酸泄露的影响Fig. 5 Effect of crude Z21 fermentation broth extract on nucleic acid leakage of T. koningii hyphae

3 讨论与结论

甲基营养型芽孢杆菌Z21发酵液对黑曲霉、康氏木霉等真菌有很强的抑菌活性[27]，150 μL无菌发酵液对康氏木霉的抑制率最高达72%左右。随着人们对食品安全的认识和要求不断提高，化学防腐剂的使用已成为一个严峻的挑战。因此，安全、高效和低成本的生物防腐剂将成为防腐剂的发展趋势[24]。芽孢杆菌属的细菌可生成抑菌活性物质，对霉菌的生长有较强的抑制作用[38]，且芽孢杆菌属对人、畜和环境安全，成为开发天然生物防腐剂的热点研究之一。武利勤等[39]发现甲基营养芽孢杆菌RA对棉花黄萎病菌和禾谷镰孢菌等9种植物病原菌抑制率均在50%以上。采俊香等[40]研究表明甲基营养型芽孢杆菌G-5产生的抗菌蛋白对多种植物病原真菌有较好抑菌效果。He等[21]通过试验得到甲基营养芽孢杆菌BCN2对从采后枇杷果实中分离出的5种病原真菌有抑制作用，使枇杷果实保鲜期达10 d。

Z21菌发酵液耐热，耐酸、碱，对紫外线、许多酶和金属离子不敏感，这与前人的研究结果相似，解淀粉芽孢杆菌W10产生的新型小抗菌肽5240在100 ℃处理20 min和pH 4～10范围内可以保持其抑菌活性[41]，甲基营养型芽孢杆菌G-5[40]、Hg18[42]产生的抗菌蛋白具有较好的光、热稳定性和酸碱稳定性。Lee等[43]从韩国传统发酵大豆食品分离出一株芽孢杆菌，产生的抗菌物质Anti-LM7在pH4～9和80 ℃作用30 min均保持较强的抗菌活性。吴艳清等[44]研究发现芽孢杆菌YQ5产生的抑菌物质对高温、pH（2～12）、紫外线照射均不敏感。由此可见，Z21菌产生的活性物质不仅抑菌率较高，且稳定性较好，具有开发为天然生物防腐剂的潜力和应用前景。