基于粪便代谢组学技术丹贝益肺方对肺纤维化伴抑郁大鼠的作用机制研究

蔡萧君,王 钦,江柏华,刘 松,李 宇,吴圆圆,胡 杨,颉彦鹏(黑龙江省中医药科学院内分泌科,哈尔滨 150036;通讯作者,E-mail:ssycxj@163.com)

肺纤维化是一种病因不明的致死性肺部疾病。患者表现为肺功能减退、呼吸困难和干咳[1-7]。异常的肺泡上皮伤口愈合和促纤维化途径的激活被认为是肺纤维化的主要始发事件[8]。在不确定的情况下,临床诊断需要兼容的放射学成像技术及侵入性方法,如支气管镜和外科肺活检等,给患者及家庭带来极大的压力和痛苦。目前,肺纤维化的病理生理机制尚不完全清楚,且患者可能会长期伴有呼吸困难等症状,长此以往会诱发患者心理上的障碍,导致抑郁症等心理疾病[9,10]。因此,针对性地诊断两种疾病的“结合状态”是有效治疗的关键。

丹贝益肺方出自黑龙江省中医药科学院,由江柏华教授自拟经验而成;组成为丹参、黄芪、平贝、党参、麦冬、桔梗、川芎、桃仁、五味子、补骨脂、地龙等;其对肺纤维化疗效确切[11-26]。但其组方复杂、体内作用机制不明确,这严重影响了该方剂的临床有效应用。本研究采用最新的非靶向的、高通量的粪便代谢组学技术,在无损伤的前提下获取生物体全面的生物学信息,为客观、全面认识肺纤维化伴抑郁症的发病机制和有效药物的作用机制提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

UltiMate 3000-Q-Exactive液质联用系统(美国,Thermo Fisher公司);Toledo MS204TS电子天平分析天平(美国梅特勒-托利多公司);酶标仪(MS芬兰,型号:Labsystems Multiskan);ZJHK-40L超纯水机(天津卓精虹科仪器设备技术有限公司);丹参、平贝、桃仁、地龙、川芎、桔梗、黄芪、党参、补骨脂、麦冬、五味子购自于哈尔滨世一堂有限公司,经蔡萧君教授鉴定为正品;水合氯醛(上海源叶生物技术有限公司);谷胱甘肽试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、丙二醛试剂盒购自于京建成生物工程研究所(批号20191101、20190204、20191112);IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:ml063132);IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:ml064292);TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:ml077385);博莱霉素:日本化药株式会社;脂多糖(Sigma-Aldrich公司,批号:L2630-100 mg)。

1.2 动物

雄性清洁级SD大鼠30只,体质量(150±20)g;黑龙江省中医药科学院动物实验室提供(动物许可证号SCXK(黑)2019-0004);饲养环境:温度(22 ±5)℃,湿度54% ±19%;给与大鼠标准饲料和饮水。为排除性别因素引入的系列干扰,且考虑肺纤维化伴抑郁复合模型对动物体质要求较高,故本实验选取健康雄性SD大鼠。

1.3 丹贝益肺方溶液配制

丹贝益肺方由丹参、贝母、川芎、桃仁、地龙、黄芪、党参片、麦冬、五味子、补骨脂、桔梗等组成,药物饮片由黑龙江省中医药科学院中药局提供,水煎浓缩制成生药浓度为0.6 g/ml的水煎液[26],大鼠灌胃剂量为6 g/kg。

1.4 模型复制及样本制备

健康雄性SD大鼠24只,根据实验第0天体质量随机分为三组,即对照组、模型组、丹贝益肺方组。所有大鼠在适应环境1周后给与10%水合氯醛进行麻醉,对照组大鼠气管内注射磷酸盐缓冲液,同时腹腔注射无菌生理盐水,每日1次,连续4 d。模型组及丹贝益肺方组大鼠气管内注射博莱霉素(5 mg/kg),同时连续4 d腹腔注射脂多糖(0.5 mg/kg)建立抑郁模型[27],造模1 d后丹贝益肺方组大鼠灌胃给与丹贝益肺方进行干预(每天1次,剂量6 g/kg),连续28 d。收集所有组实验第28天粪便,-80 ℃保存,以电子天平精确称取100 mg的粪便样品,置于1.5 ml的离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.0);涡旋震荡10 min、超声15 min,离心(12 000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液400 μl用于代谢组学分析。实验第29天,以1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠,血清样本和大脑前额皮质组织用于1.5部分检测生化指标。其中收集的新鲜血液样本静置30 min后离心(4 ℃,3 000 r/min,10 min),取上清液置于-80 ℃保存,脑组织置于液氮环境5 min后-80 ℃保存。

1.5 检测各组大鼠MDA、GSH、SOD、IL-1β、IL-6、TNF-α活性

分离的大脑前额叶皮质制备组织匀浆,离心(4 ℃,12 000 r/min,10 min),收集上清液,采用生化分析仪测定MDA、GSH、SOD含量,按照ELISA检测试剂盒操作说明书检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平。

1.6 大鼠定位航行实验

实验阶段隔1星期进行1次水迷宫实验,记录各组大鼠找到平台花费时间。

1.7 粪便代谢组学分析条件

UltiMate 3000-Q-Exactive液质联用系统(美国,Thermo Fisher公司),柱温45 ℃,流速0.4 ml/min,锥孔电压正离子3 500 V、负离子2 500 V。流动相A(0.1%甲酸水),流动相B(0.1%乙腈)。粪便代谢物梯度洗脱条件:0～1 min,98%A;1～2 min,95%～80%A;2～6 min,80%～40%A;6～10 min,40%～98%A。

1.8 数据处理与统计学分析

采用Compound Discoverer 3.2小分子数据处理系统,将获取到的Raw文件直接带入,并进行数据预处理和数据处理流程,以Student’sttest,P<0.05且倍数差(fold change)>1的值为差异代谢物标准,结合开源的MzCloud标准品数据库进行精准鉴定。生化指标采用SPSS 18软件以Student’sttest进行单变量分析比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标结果

各组大鼠前额皮质中IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA、GSH和SOD的表达比较结果见表1。与对照组相比,模型组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,丹贝益肺方组IL-1β、IL-6和TNF-α均呈现显著降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组MDA、GSH、SOD显著降低(P<0.05);与模型组比较,丹贝益肺方组MDA、GSH和SOD指标均显著增加(P<0.05)。

表1 各种大鼠肺纤维化及抑郁症生化指标结果

2.2 大鼠定位航行能力结果

与对照组相比,模型组大鼠定位平台时间显著增加(P<0.05);与模型组相比,丹贝益肺方组定位平台的时间明显减少(P<0.01)。说明模型组大鼠定位能力下降,给予丹贝益肺方有明显回调作用。

表2 大鼠水迷宫定位航行结果

2.3 大鼠粪便代谢组学研究

通过主成分分析可知,三组大鼠的粪便的代谢轮廓聚类明显,由组间聚类可知对照组和模型组分离明显(见图1),证明肺纤维化伴抑郁症大鼠的整体代谢发生变化,致使与健康状态大鼠发生显著分离,给与丹贝益肺方治疗后,发生回调,部分大鼠整体代谢状态与对照组一致,证明丹贝益肺方对肺纤维化伴抑郁症的疗效显著。

图1 肺纤维化伴抑郁症大鼠粪便PCA得分图Figure 1 Fecal PCA score of rats with pulmonary fibrosis and depression

进一步通过火山图筛选生物标记物,对空白组和模型组代谢数据进行t检验及Fold Change分析,生物标记物结果见表3,图2。

与模型组比,丹贝益肺方组5个生物标记物有降低趋势,但不具有统计学差异。对获取到的5个生物标记物进行代谢通路分析可知,肺纤维化伴抑郁症大鼠主要涉及色氨酸代谢和嘌呤代谢(见图3)。为可视化丹贝益肺方在治疗肺纤维化合并抑郁症的作用机制,将涉及的标记物及关键代谢酶带入Cytoscape3.2.1软件进行通路分析,绘制针对“肺纤维化伴抑郁症的代谢通路图”。如图3所示,本次复合模型得到的5个生物标记物中,只有3个涉及在代谢网络中,即犬尿酸、肌苷和硫酸雄甾酮。此代谢过程涉及多个代谢酶及代谢产物,且上述3种代谢酶都处于核心位置,将多个代谢酶及其他成分进行关联,由此推断丹贝益肺方可能通过上述靶标的调节达到整体调节代谢通路、有效干预代谢通路中其他代谢成分的目的。

表3 肺纤维化伴抑郁症大鼠粪便生物标志物信息

圆圈代表代谢物,红色和绿色圆圈代表FC小于1,同时t检验绝对值小于0.05的代谢组,蓝色圆圈为符合标准的代谢物图2 肺纤维化伴抑郁症大鼠粪便火山图Figure 2 Fecal volcanogram of rats with pulmonary fibrosis and depression

3 讨论

临床上肺纤维化患者因长期患病对生活和工作引入生理及病理状态,多数伴有不同程度的抑郁症发生。精准针对及有效预防此类复合型疾病的应对措施是控制这一发病率高、危害性大疾病的有效手段。本研究采用高通量的组学技术对粪便代谢物数据进行采集和分析,在对生物体无损伤的前提下发现了与抑郁症相关的一系列代谢物变化,为临床抑郁症生物标记物及有效诊断提供实验依据。

模型组大鼠粪便代谢物中一致地发现溶血磷脂胆碱(LysoPC)成分的显著性变化,LysoPC是溶血磷脂酸的前体,溶血磷脂酸是一种具有生物活性的甘油磷脂。在脂肪酸的长度和饱和度上,存在多种不同的溶血磷脂酸类型。溶血磷脂酸涉及全身性硬化或多发性硬化、神经性硬化、溶血磷脂酸炎症、胚胎性硬化。溶血磷脂酸通过上皮细胞死亡、血管渗漏和成纤维细胞迁移和增殖诱导肺、肾和肝纤维化[28-30]。溶血磷脂酸受体1的基因抑制和自体毒素酶的拮抗都可以预防肺纤维化。溶血磷脂酸受体1缺陷小鼠在博莱霉素损伤后没有发生肺纤维化[31]。此外,溶血磷脂酸受体2基因敲除小鼠在应用博莱霉素后不会出现肺纤维化。此外,人肺成纤维细胞中TGF-β的表达受到抑制[32]。目前,溶血磷脂酸的来源尚不清楚。溶血磷脂酸的生产至少有两种不同的来源。一种是磷脂酶A1和A2水解细胞膜上的磷脂酸。但大多数溶血磷脂酸是由溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰丝氨酸的酶切产生的,溶血磷脂酰丝氨酸是由溶血磷脂酰磷酸酶D活性的自毒素(ATX)产生的。在肺纤维化患者体内上皮细胞损伤,特别是2型肺泡上皮细胞,被认为是引发纤维化过程的原因。肺损伤后,二棕榈酰磷脂酰胆碱作为主要的表面活性物质脂质成分,被2型肺泡上皮细胞的磷脂酶A2活性降解为溶血磷脂酰胆碱。这与本次实验发现的模型组大鼠粪便代谢物中LysoPC表达水平升高一致。给与丹贝益肺方进行治疗后,其含量有降低趋势,证明丹贝益肺方能靶向性调节磷脂酶A2活性,最终达到调节代谢物LysoPC含量的目的。

犬尿酸与抑郁症有极为密切的关系,抗抑郁药治疗前抑郁症患者血浆犬尿酸浓度与疾病严重程度的关系最为显著。然而,是否有代谢物或单核苷酸多态性基因型可能与抑郁症症状的基线严重程度相关尚不清楚。抑郁症的病理生理几乎肯定是异质性的。大量的数据支持单胺类神经传递的变异有助于抑郁症病理生理学的假说。此外,炎症也可能在抑郁症病理生理学中起重要作用。与非抑郁症患者相比,抑郁症患者的促炎性细胞因子浓度已显示出增加,并且与抑郁症状的严重程度呈正相关[33-35]。此外,感染、内毒素暴露、细胞因子的治疗性应用和心理压力都会引发炎症并导致抑郁症状。肠道微生物相关的炎性细胞因子释放也可能是通过“微生物群—肠道—大脑”轴导致抑郁症状的机制。重要的是,具有高水平炎症的抑郁症患者对传统的抗抑郁治疗反应不佳,但他们可能对细胞因子拮抗剂有反应。此外,“神经传递”和“炎症”假说并不相互排斥,可能与色氨酸代谢有关。色氨酸是5-羟色胺和犬尿酸的前体。鉴于5-羟色胺神经传递的重要性,色氨酸代谢从5-羟色胺分流到犬尿酸生物合成途径可能有助于抑郁症的病理生理学。“犬尿酸途径”的第一步由吲哚胺2,3-双加氧酶1和吲哚胺2,3-双加氧酶1或色氨酸2,3-双加氧酶2催化。炎性细胞因子可增加吲哚胺2,3-双加氧酶的表达,从而激活“犬尿酸途径”,导致出现抑郁样行为。犬尿酸与5-羟色胺不同,它能穿过血脑屏障,大脑中的大部分犬尿酸来源于外周血。犬尿随后被犬尿酸途径氨基转移酶进一步代谢,产生下游代谢物,例如具有神经保护作用的犬尿喹啉酸。这些下游代谢物可通过其对N-甲基-D-天冬氨酸受体的作用在疾病病理生理学中发挥作用。这可能是导致抑郁症症状的机制。综上所述,本次实验发现的犬尿酸含量异常与模型中抑郁症的表现一致,给与丹贝益肺方治疗后呈显著回调趋势,在以方验证的同时,证实了犬尿酸与肺纤维化伴抑郁症的高度相关性,由下游代谢物的含量变化推测丹贝益肺方可能通过干预上游的5-羟色胺等神经递质的活性,达到干预疾病的目的,同时犬尿酸可能作为肺纤维化伴抑郁症的有效的临床诊断方式之一。

图3 肺纤维化伴抑郁症大鼠粪便代谢通路图Figure 3 Fecal metabolic pathway of rats with pulmonary fibrosis and depression

通过上述针对性的聚焦分析发现,本次得到的5个粪便生物标记物对肺纤维化伴抑郁症有直接相关的内在联系;通过给与丹贝益肺方后得到有效回调,这验证了生物标记物与疾病及药物的高度响应程度;通过代谢通路分析发现,丹贝益肺方对肺纤维化伴抑郁症有良好的疗效。调节嘌呤代谢、色氨酸代谢通路可能是其治疗肺纤维化伴抑郁症的作用机制。