广东不同玉米基因型幼胚愈伤组织诱导差异研究

何慧怡 陈勇生 崔方庆 齐永文 劳方业

摘要 [目的]针对广东玉米品种建立高效遗传再生技术体系。[方法]以穗甜1号、广糯1号和广黑甜3个玉米品种的幼胚为外植体，研究N 6培养基中不同浓度的L-Pro、AgNO 3、2，4-D对愈伤组织诱导率和胚性愈伤率的影响。[结果]较高浓度的Pro（1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈伤组织诱导，而继代时在N 6培养基中添加29.43 μmol/L AgNO 3则可获得较多高质量的胚性愈伤组织;对3个玉米品种而言，培养基中2，4-D的适宜浓度为1～2 mg/L。3种基因型的外植体均可诱导出愈伤组织，但基因型和激素种类与浓度均影响愈伤组织诱导效率。[结论]在实际应用中，应根据不同基因型选择最佳的L-Pro、AgNO 3和2，4-D浓度配比，以获得较多高质量的胚性愈伤组织。

关键词 玉米;幼胚;愈伤组织;诱

中图分类号 S513  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）05-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Differences of Callus Initiation from Immature Embryos Among Three Varieties of Maize in Guangdong

HE Hui-yi，CHEN Yong-sheng，CUI Fang-qing et al

（Institute of Nanfan & Seed Industry，Guangdong Academy of Sciences，Guangzhou，Guangdong 510316）

Abstract [Objective]To establish high-frequency regeneration technique system for gene tranformation in maize in Guangdong.[Method]The effects of different concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） in N 6 medium on both the callus induction rate and embryogenic callus rate were analyzed with the immature embryos of 3 maize varieties Suitian 1，Guangnuo 1 and Guangheitian used as materials.[Result]The results showed that the percentage of inducing callus was increased evidently with the addition of L-Proline （1 000-1 300 mg/L），and it was optimal for improving the induction percentage of embryogenic callus to add AgNO 3 （29.43 μmol/L） in N 6 medium during subculture;In addition，for 3 tested maize varieties，the most suitable concentration of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） was 1-2 mg/L callus were grown from immature embryos of all the three genetypes，but both genotypes and types and concentrations of phytohormone affcted the frequency of embryogenic callus formation.[Conclusion]In practice，the optimal concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） were necessary to determined for different genotypes in callus induction in order to increase the induction percentage of embryogenic callus.

Key words Maize;Immature emhryos;Callus;Initiation

基金項目 国家现代农业产业技术体系（CARS201707）;国家自然科学基金项目（32072027）;广东省重点领域研发计划项目（2019B020238001）;广东省良种重大科研攻关项目（粤财农2019（73）号）。

作者简介 何慧怡（1981—），女，广东广州人，高级农艺师，硕士，从事生物育种研究。*通信作者，研究员，博士，从事生物育种研究。

收稿日期 2021-05-31

随着畜牧业的发展和人们生活水平的不断提高，玉米成为粮食、饲料、经济兼用的作物，在国民经济中占有愈来愈重要的地位[1]。其中，玉米组织培养和基因转化研究一直是国内外的研究热点之一[2-10]。自1975年Green等[2]利用玉米幼胚作为外植体进行愈伤组织的诱导并成功获得二倍体再生植株以来，国内科研人员相继以幼穗[3-4]、花药[5]、芽顶端分生组织[6]等作为外植体成功获得植株再生。然而，由于玉米幼胚具有接种方便及易于愈伤组织诱导等优点，因此，幼胚仍是目前玉米组织培养中广泛使用的外植体类型[4，8-10]。但是，不同基因型玉米幼胚组织培养的效率差异较大[4，11-12]，制约了幼胚在玉米基因工程研究中的应用。为了不断完善以玉米幼胚为外植体的组织培养技术，使其能更有效地在玉米基因工程上应用，该研究在前人研究的基础上[4，8-12]，采用L 9（33）正交试验设计了9种不同诱导培养基对3种不同类型的广东玉米品种（穗甜1号、广糯1号和广黑甜）进行诱导愈伤组织研究，旨在进一步探索建立高效遗传再生体系的条件，为建立高效的特定玉米品种转基因受体系统奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料包括3个玉米品种，分别为穗甜1号、广糯1号和广黑甜，2018年种植于广东省科学院生物工程研究所试验田块，8月进行人工授粉。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体幼胚的获取。在开花授粉期对3个品种进行人工套袋，均于授粉后第12天取雌穗剥去外层苞叶，在超净台上用75%乙醇浸泡5 min，再用无菌水冲洗3遍，然后用手术刀削去籽粒上端，使幼胚露出，接着用解剖针取出幼胚，盾片向上，接种到诱导培养基上。

1.2.2 愈伤组织诱导和继代。诱导和继代培养基是在N 6基础培养基中添加不同浓度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、硝酸银（AgNO 3）和L-脯氨酸（L-Pro），采用3因素3水平正交试验L 9（33）（表1），每处理接种20皿，每皿20个幼胚。7 d后及时切除胚根和胚芽进行一次继代培养，14 d后统计愈伤组织诱导率和胚性愈伤率，确定最适宜的配比浓度。

1.2.3 培养条件。诱导培养和继代培养均为暗培养，温度为（28±1）℃。

2 结果与分析

2.1 穗甜1号愈伤诱导方差分析

2.1.1 显著性。由于区组和C因素项的均方与误差均方差

异不大，所以计算合并误差均方进行F测验（当方差分析遇到某变异项的均方与误差均方相差不大，特别是小于误差均方时，常将该项平方和与误差平方和合并相加，其相应的自由度也合并相加，求得合并误差均方，以提高F测验的精度[13]）。结果表明，穗甜1号在胚性愈伤率方面，A、B因素各水平间达到极显著，而在愈伤组织诱导率方面，A、B和C 3因素各水平间都达到显著或极显著（表2）。因此，分別对穗甜1号胚性愈伤率和愈伤组织诱导率的显著因素水平进行多重比较，结果见表3、4。

2.1.2 A、B因素各水平间胚性愈伤率比较。由表3可知，在A因素方面，穗甜1号A 2和A 3处理的胚性愈伤率分别极显著和显著高于A 1，而A 2和A 3之间无显著差异;在B因素方面，穗甜1号B 2处理的胚性愈伤率分别显著和极显著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈伤率极显著高于B 1。

从表2方差分析结果中各因素的F值大小可确定穗甜1号在胚性愈伤率方面的因素主次顺序为B、A、C;根据多重比较结果（表3）可知，A因素最优水平为A 2，B因素最优水平为B 2，C因素不显著，其因素水平可任取，故该试验穗甜1号胚性愈伤率的最优处理组合为A 2B 2C 0，即最优处理组合是1 000 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2，4-D 3种浓度均可。

2.1.3 A、B、C因素各水平间愈伤组织诱导率比较。由表4可知，在A因素方面，穗甜1号A 3处理的愈伤组织诱导率显著高于A 1，A 2介于A 1和A 3之间，且与A 1、A 3之间均无显著差异;在B因素方面，穗甜1号B 2和B 1处理的愈伤组织诱导率分别极显著和显著高于B 3，而B 2和B 1之间无显著差异;在C因素方面，穗甜1号C 2和C 3处理的愈伤组织诱导率均显著高于C 1，而C 2和C 3之间无显著差异。

从方差分析结果（表2）中各因素的F值，可确定穗甜1号在愈伤组织诱导率方面的因素主次顺序亦为B、A、C;根据表4的多重比较结果可知，A因素最优水平为A 3，B因素最优水平为B 2，C因素较优水平为C 2和C 3，故该试验穗甜1号在愈伤组织诱导率方面的最优处理组合应为A 3B 2C 2或A 3B 2C 3，即最优处理组合是1 300 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2或3 mg/L 2，4-D。

2.2 广糯1号愈伤诱导方差分析

2.2.1 正交试验结果及显著性。根据广糯1号愈伤诱导正交试验结果进行方差分析，结果见表5。由表5可知，广糯1号在胚性愈伤率方面，B、C因素各水平间达到极显著，而在愈伤组织诱导率方面，B因素各水平间达到极显著。因此，分别对广糯1号胚性愈伤率和愈伤组织诱导率的显著因素水平进行多重比较，结果见表6、7。

2.2.2 B、C因素各水平间胚性愈伤率比较。由表6可知，在B因素方面，广糯1号B 2处理的胚性愈伤率分别显著和极显著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈伤率极显著高于B 1;在C因素方面，广糯1号C 2处理的胚性愈伤率极显著高于C 3和C 1，C 3和C 1间的胚性愈伤率无显著差异。

从方差分析结果（表5）中各因素F值大小可确定广糯1号在胚性愈伤率方面的因素主次顺序为B、C、A，其中A因素不显著，因此其水平可任取。由表6可知，B因素最优水平为B 2，C因素最优水平为C 2，故该试验广糯1号在胚性愈伤率方面的最优处理组合应为A 0B 2C 2，即最优处理组合是L-Pro 3种浓度均可，29.43 μmol/L AgNO 3，2 mg/L 2，4-D。

2.2.3 B因素各水平间愈伤组织诱导率比较。由表7可知，在B因素方面，广糯1号B 1和B 2处理的愈伤组织诱导率间无显著差异，但均极显著高于B 3。

从方差分析结果（表5）中各因素F值大小可确定广糯1号在愈伤组织诱导率方面的因素主次顺序为B、C、A;由于A、C因素均不显著，因素水平均可任取，B因素B 1和B 2水平较优，故广糯1号在愈伤组织诱导率方面的最优处理组合应为A 0B 1C 0或A 0B 2C 0，即最优处理组合是L-Pro和2，4-D 3种浓度均可，不添加AgNO 3或AgNO 3浓度为2943  μmol/L。

2.3 广黑甜愈伤诱导方差分析2.3.1 正交试验结果及显著性分析。F测验结果（表8）表明，广黑甜在胚性愈伤率和愈伤组织诱导率方面，A、B、C 3因素各水平间均达到极显著差异，因此，分别对广黑甜胚性愈伤率和愈伤组织诱导率的各因素各水平进行多重比较，结果见表9、10。

2.3.2 各因素水平间胚性愈伤率比较。由表9可知，在A因素方面，广黑甜A 3处理的胚性愈伤率分别显著和极显著高于A 2和A 1， A 2极显著高于A 1;在B因素方面，广黑甜B 2和B 3处理的胚性愈伤率均极显著高于B 1，而B 2和B 3之间无显著差异;在C因素方面，广黑甜C 1处理的胚性愈伤率极显著高于C 2和C 3，而C 2和C 3之间无显著差异。

由表8方差分析结果中各因素F值大小可确定广黑甜在胚性愈伤率方面的因素主次顺序为A、B、C;根据多重比较结果（表9），A因素较优水平为A 3，B因素较优水平为B 2和B 3，C因素最优水平为C 1，故广黑甜在胚性愈伤率方面的较优处理组合应为A 3B 2C 1或A 3B 3C 1，即较优处理组合是1 300 mg/L L-Pro，29.43或58.86  μmol/L AgNO 3，1 mg/L 2，4-D。

2.3.3 广黑甜各因素水平间愈伤组织诱导率比较。

由表10可知，在A因素方面，广黑甜A 3处理的愈伤组织诱导率极显著高于A 2和A 1，A 2极显著高于A 1;在B因素方面，广黑甜B 1和B 2处理的愈伤组织诱导率均极显著高于B 3，而B 1和B 2之间无显著差异;在C因素方面，广黑甜C 1处理的愈伤组织诱导率分别显著和极显著高于C 3和C 2，C 3极显著高于C 2。

从方差分析结果（表8）中各因素F值大小可确定广黑甜在愈伤组织诱导率方面的因素主次顺序亦为 A、B、C;根据表10的多重比较结果可知，A因素最优水平为A 3，B因素为B 1和B 2，C因素为C 1，故广黑甜在愈伤组织诱导率方面的最优处理组合应为A 3B 1C 1或A 3B 2C 1，即最优处理组合为1 300 mg/L L-Pro，不添加AgNO 3或29.43  μmol/L AgNO 3，1 mg/L 2，4-D。

3 討论

3.1 培养基中2，4-D、AgNO 3和L-Pro浓度的确定

在一定的浓度范围内，AgNO 3有利于玉米愈伤组织诱导[14-16]，也证实一些特殊基因型的诱导必须添加AgNO 3 [17]。Songstad等[18]研究认为，植物细胞在体外培养过程中会产生乙烯，在密闭的培养瓶或培养皿中，乙烯积累到较高浓度就会影响到植物细胞的生长发育;而Ag+是一种较好的乙烯活性抑制剂，能通过竞争性结合细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而起到阻止或降低乙烯的作用。王汉宁等[19]通过试验发现，在培养基中添加AgNO 3，可明显防止褐化现象发生。但也有研究发现AgNO 3在诱导形成愈伤组织的作用方面效果不明显[20]。

该研究发现，对于甜玉米品种穗甜1号，适当添加AgNO 3（浓度为29.43 μmol/L）有利于其幼胚愈伤组织诱导;而对于糯玉米品种广糯1号和广黑甜，在诱导培养基中添加AgNO 3对提高愈伤组织的诱导效果不明显，但在继代时添加AgNO 3（浓度为29.43 μmol/L），可获得较多高质量的胚性愈伤组织。

L-Pro有促进玉米愈伤组织胚性化的作用[21]。付凤玲等[22]研究认为，培养基中L-Pro浓度对玉米胚性愈伤组织诱导率有显著影响，在N 6培养基中添加适量L-Pro，可提高胚性愈伤组织诱导率;窦秉德等[20]研究发现，添加了L-Pro的培养基在出愈率和愈伤质量方面均明显优于未添加的培养基，因此也认为添加L-Pro是必要的。笔者研究发现，对3个参试玉米品种而言，较高浓度L-Pro（浓度为1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈伤组织诱导，这与李金红等[23]的试验结果一致。

禾谷类作物组织培养和体细胞胚性诱导过程中，2，4-D的应用十分普遍，主要起脱分化作用[19]。已有研究表明[10，24]，在玉米幼胚培养中，添加2，4-D是诱导愈伤组织形成的关键因子，且随着添加的2，4-D浓度增大，愈伤组织诱导率呈抛物线形变化，当浓度继续升高时，愈伤组织的诱导率有所下降，因为高浓度的2，4-D易导致体细胞无性系变异[25]。该试验研究发现，当培养基中2，4-D为1～2 mg/L时，对3个玉米品种的幼胚愈伤组织诱导效果较好，这与上述的研究结果基本一致。

3.2 不同基因型诱导培养基中最佳的2，4-D、AgNO 3和L-Pro浓度配比不同

该试验的3个参试玉米品种中，穗甜1号为甜玉米品种，其在AgNO 3浓度为29.43 μmol/L、L-Pro浓度为1 300 mg/L、2，4-D为2或3 mg/L时，有利于诱导愈伤组织;而在AgNO 3浓度为29.43 μmol/L、L-Pro浓度为1 000 mg/L、2，4-D 3种浓度均可时，其胚性愈伤率表现好。

广糯1号为糯玉米品种，其在不添加AgNO 3或浓度为29.43 μmol/L、L-Pro和2，4-D 3种浓度均可时，其愈伤组织诱导率较好;而在AgNO 3浓度为29.43 μmol/L、2，4-D为2 mg/L、L-Pro 3种浓度均可时，其胚性愈伤率较好。

广黑甜为紫糯玉米品种，不添加AgNO 3或浓度为29.43 μmol/L、L-Pro浓度为1 300 mg/L、2，4-D浓度为1 mg/L时，其愈伤组织诱导率较好;AgNO 3浓度为29.43或58.86 μmol/L、L-Pro浓度为1 300 mg/L、2，4-D浓度为1 mg/L时，其胚性愈伤率较好。

综上，对于该研究供试的3个不同玉米品种类型，试验通过幼胚愈伤诱导培养均能诱导出愈伤组织，但基因型和激素种类与浓度均能影响愈伤组织诱导效率，即基因型和培养基中激素的种类与浓度之间存在相互作用，不同基因型间在相同培养条件下或同一基因型在培养基中含不同种类与浓度的激素时，其愈伤诱导率存在差异，因此，不同基因型的培养基中适宜的2，4-D、AgNO 3和L-Pro浓度配比不同，这与以往的研究结果一致[4，11-12]。另一方面，植物组织培养技术是生物工程研究的基础，是植物遗传转化与品种改良研究的基本技术环节之一，而禾谷类作物中玉米作为重要的粮食作物和饲料作物，其组织培养要比水稻、小麦等作物困难[10，26]。因此，有必要对每种特定玉米材料进行大量试验以确定对应的培养基成分，从而提高愈伤组织诱导效率，获得高质量的胚性愈伤组织。

参考文献

[1]苏广达.作物学[M].广州：广东高等教育出版社，2000：150-171.

[2] GREEN C E，PHILLIPS R L.Plant regeneration from tissue cultures of maize[J].Crop science，1975，15（3）：417-421.

[3] 李效宇，徐龙珠，张根发.玉米幼穗离体培养体细胞胚高频发生的研究[J].西北植物学报，1997，17（3）：405-409.

[4] 黄璐，卫志明.不同基因型玉米的再生能力和胚性与非胚性愈伤组织DNA的差异[J].植物生理学报，1999.25（4）：332.

[5] 杜娟，母秋华，贾玉峰，等.利用桥接组合的转育方法提高玉米花药培养诱导率的研究[J].玉米科学，1999，7（3）：16-18.

[6] 李学红，张举仁.玉米茎尖离体培养直接产生雌、雄花序的研究[J].中国科学（C辑），1999，29（2）：186-193.

[7] 李余良，胡建广.转基因玉米研究进展[J].中国农学通报，2006，22（3）：71-75.

[8] 陈英，曹毅，周先礼，等.玉米幼胚的组织培养及其植株再生的研究[J].四川大学学报（自然科学版），1999，36（6）：1125-1129.

[9] 杜娟，余云舟，张领兵，等.玉米自交系II型胚性愈伤组织诱导及遗传转化初报[J].吉林农业大学学报，2000，22（4）：41-44.

[10] 龚娜，杨涛，肖军，等.玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生研究[J].江苏农业科学，2010，38（6）：84-85.

[11] 胡彦民，汤继华，刘宗华，等.玉米幼胚高培养力基因型的筛选[J].河南科学，2004，22（1）：63-66.

[12] 陈莉，窦秉德，程朝霞，等.甜玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生研究[J].江苏农业科学，2009，37（6）：70-71.

[13] 张全德，胡秉民.农业试验统计模型和BASIC程序[M].杭州：浙江科学技术出版社，1985：282-301.

[14] 孙红炜，尚佑芬，杨崇良，等.影响玉米愈伤组织诱导和植株再生的有关因素研究[J].山东农业科学，2002，34（6）：30-31.

[15] 肖莉杰，苍晶，徐仲，等.黑龙江省骨干玉米自交系愈伤组织的诱导及植株再生[J].东北农业大学学报，2003，34（1）：63-67.

[16] 吕颖颖，史振声，李凤海，等.玉米幼胚组织培养的研究与进展[J].安徽农业科学，2012，40（31）：15144-15145，15173.

[17] 杨会，王国英，戴景瑞.玉米优良自交系综3、综31的转化研究[J].农业生物技术学报，2001，9（4）：334-337，410.

[18] SONGSTAD D D，ARMSTRONG C L，PETERSEN W L.AgNO 3 increases type  II  callus production from immature embryos of maize inbred B73 and its derivatives [J].Journal of plant physiology，1991，9：699-702.

[19] 王汉宁，张金文，孔維萍，等.玉米幼胚愈伤组织诱导及再生[J].玉米科学，2006，14（5）：71-73，86.

[20] 窦秉德，张永霞，陈莉.脯氨酸和硝酸银对甜玉米幼胚愈伤组织诱导与分化的影响[J].淮阴师范学院学报（自然科学版），2006，5（3）：233-237.

[21] 赵天永，王国英，黄忠，等.玉米愈伤组织对草丁膦的抗性及氨基酸对这种抗性的影响[J].植物学报，1998，40（11）：1010-1014.

[22] 付凤玲，张莉萍，朱祯.玉米优良自交系转基因受体系统建立及转化后的筛选与再生[J].四川农业大学学报，2000，18（2）：97-99，108.

[23] 李金红，霍岩，付莉，等.建立玉米幼胚高效再生体系的研究[J].辽宁农业科学，2017（6）：1-5.

[24] CARVALHO C H S，BOHOROVA N，BORDALLO P N，et al.Type Ⅱ callus production and plant regeneration in tropical maize genotypes[J].Plant cell reports，1997，17（1）：73-76.

[25] CHOI H W，LEMAUX P G，CHO M J.Selection and osmotic treatment exacerbate cytological aberrations in transformed barley （Hordeum vulgare）[J].Journal of plant physiology，2001，158（7）：935-943.

[26] 梁一池，杨华.植物组织培养技术的研究进展[J].福建林学院学报，2002，22（1）：93-96.