全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的胚胎发育及仔幼鱼生长比较

龚万达，宋文，钟林，梁骁，王守荣，曾可为*

(1.华中农业大学 水产学院，湖北 武汉 430070；2.武汉市农业科学院，湖北 武汉 430072；3.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310022)

翘嘴鳜Sinipercachuatsi，又名鳜，隶属于鲈形目Perciformes鮨科Serranida鳜亚科Sinipercinae鳜属Siniperca，是中国特有的名贵淡水养殖鱼类，经济价值较高，2019年全国鳜鱼养殖产量高达33.71万t，较2018年增长6.71%[1]。鳜鱼营养价值高，肌肉脂肪中不饱和脂肪酸含量高达54.88%[2]，肉质鲜美，享有“淡水石斑”美誉。

有些重要经济鱼类与陆生脊椎动物相似，具有性别二态性，表现为雌雄形态差异和生长差异[3]，如半滑舌鳎Cynoglossussemilaevis[4]、黄颡鱼Pelteobagrusfulvidraco[5]、尼罗罗非鱼Oreochromisniloticus[6]等。根据已报道的翘嘴鳜雌雄生长差异研究发现,性成熟前雌性比雄性生长快，性成熟后则反之[7]。因此，通过鱼类性别控制育种技术获得单性鱼对鱼类单性育种和单性养殖具有重要的意义。目前，有关翘嘴鳜的研究主要集中在鳜种质遗传多样性[8]、分子标记开发[9]和病害防治[10]等方面。关于翘嘴鳜自交、翘嘴鳜与斑鳜Sinipercascherzeri杂交、翘嘴鳜与大眼鳜Sinipercakneri杂交的胚胎发育及仔稚鱼生长[11-14]研究已有一些报道，杂交后代胚胎发育时序及外部形态特征主要与母本相似，但尚未见到全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的胚胎发育及仔幼鱼生长的比较研究。

本研究中,通过利用性别控制技术获得的伪雄鳜(XX，♂)与正常雌鳜鱼(XX，♀)进行人工催产、授精获得全雌鳜(XX，♀)受精卵，将其与翘嘴鳜自交后代进行胚胎发育观察及仔幼鱼生长比较，以期为全雌鳜生产、鳜鱼单性育种及单性养殖提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用伪雄鳜、翘嘴鳜亲鱼均取自广东省佛山市南海百容水产良种有限公司，伪雄鳜亲本为1～2龄，体质量为577～1 231 g，翘嘴鳜亲本为3～4龄，体质量为1 354～2 438 g。试验于2020年6月在该公司进行。

1.2 方法

1.2.1 人工授精与孵化 挑选体表光滑无伤、体质健壮的1尾伪雄鳜、1尾雄鳜和2尾雌鳜作为亲鱼，用本实验室(武汉市水产科学研究所)开发的鳜SNP性别分子标记(暂未发表)检测所用亲本的基因型，表型为雄鱼，但基因型为XX的个体即为伪雄鳜(记为XX Δ♂)；表型为雄鱼，基因型为XY的个体是正常雄鳜(记为XY ♂)；表型为雌鱼，基因型为XX的个体是正常雌鳜(记为XX ♀)。催产所用药物为注射用多潘立酮(DOM)和注射用促黄体释放激素(LRH-A2)。雌鳜注射量为(DOM 3 mg + LHRH-A25 μg)/kg(体质量)，雄鳜剂量减半，伪雄鳜未注射。催产后的鳜亲鱼放置在水泥池中，水温为26～28 ℃，效应时间为21～24 h。采用半干法的人工授精方式制备全雌翘嘴鳜和自交翘嘴鳜受精卵。

自交翘嘴鳜受精卵是将鳜鱼卵子与精液先后挤入干净无水的铝盆中混合均匀后获得，加入纯净水激活精子并匀速搅拌，静置1 min即可；由于性诱导后的伪雄鳜精巢形状为卵巢状或畸形状(图1)。因此,全雌翘嘴鳜受精卵的获得是将伪雄鳜麻醉后解剖取其精巢，轻轻剪碎、捻磨、过滤得到伪雄鳜亲鱼精液，置于预冷的精液保存液中(伪雄鳜精液保存液配制参考超雄黄颡鱼精子保存液配方[15]，试验所用配方做适当调整)，按精液与保存液体积比为1∶5混合均匀，0～4 ℃下保存并使用显微镜检测其精液活力，活力需达到90% 以上才可用。获得雌鳜卵子后，按照与自交翘嘴鳜相同的操作方式对其人工授精，全程在阴凉环境下操作，避免阳光直接照射。受精卵置于“V”形孵化桶孵化，放卵密度为10 kg 水放1万粒卵，水温为26～28 ℃。

图1 鳜鱼精巢Fig.1 Testis of mandarin fish Siniperca chuatsi

1.2.2 胚胎发育观察 在全雌翘嘴鳜和自交翘嘴鳜的孵化过程中用体式显微镜(SZM-45T1，舜宇，中国)对其胚胎发育连续拍照观察。囊胚期以前每10 min 观察一次，器官分化阶段每0.5～1 h观察一次，详细记录胚胎发育时序及各个时期的典型特征，每次随机取卵50粒左右，胚胎发育时间以50%以上的受精卵明显进入该发育阶段为准，观察期间水温为26～28 ℃。

1.2.3 仔幼鱼生长比较 在5日龄时从各孵化桶分别挑选2 000尾全雌翘嘴鳜和自交翘嘴鳜暂养于水泥池(2 m×2 m×1.5 m)中，直至60日龄，每组设置3个平行。在生长过程中，采用随机抽样的方法，对摄食3 h后的鱼苗取样，每5～7 d取样一次，每次抽取50 尾，用数显游标卡尺测量其全长与体长(精确到1 mm)，用电子天平称量其体质量(精确到0.01 g)。全长与体质量的关系为

W=aLb。

其中：W为体质量(g)；L为全长(cm)；a、b为常数，参数b表示鱼的体质量增加系数与全长增长系数之比，当b=3时，体质量表现为匀速生长，b≠3时，则表现为异速生长。

1.3 数据处理

试验结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜胚胎发育时序比较

全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的胚胎发育时序无明显差异；在水温为26～28 ℃条件下，全雌翘嘴鳜受精卵从受精到出膜历时39 h 12 min，自交翘嘴鳜用时38 h 44 min，全雌翘嘴鳜比自交翘嘴鳜晚28 min(表1)。

表1 自交翘嘴鳜与全雌翘嘴鳜的胚胎发育时序Tab.1 Embryonic development timing of the self-bred and the all-female mandarin fish Siniperca chuatsi

2.2 全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的胚胎发育特征

翘嘴鳜从受精卵到孵化出膜经历了7个连续发育阶段：受精、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成和孵化出膜阶段，全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的胚胎发育在各阶段的特征都十分相似，整个过程可分为20个时期(图2)。

2.2.1 受精阶段 受精卵受精后，遇水后卵膜迅速吸水膨胀，外周原生质在动物极集中并在卵黄囊上方隆起形成胚盘，进入胚盘期(图2A)。

2.2.2 卵裂阶段 受精卵的胚盘卵裂仅在动物极发生，在胚盘中央形成一条卵裂沟以盘状卵裂的方式进行分裂，每卵裂一次细胞呈2的次方增加，依次经过2细胞期(图2B)、4细胞期(图2C)、8细胞期、16细胞期(图2D)直至128细胞期(多细胞期)(图2E)。

2.2.3 囊胚阶段 随着细胞卵裂次数的增加，细胞间的界限模糊不清，胚盘处堆积形成一个呈高帽状的高囊胚，即囊胚早期(图2F)；细胞进一步分裂，囊胚细胞从受精卵动物极向植物极一端移动，胚层降低，其高度约为1/5的卵径，进入囊胚中期(图2G)；细胞分裂继续，胚层进一步降低，囊胚层变扁，胚胎形状与胚盘隆起期相似，进入囊胚晚期(图2H)。

2.2.4 原肠胚阶段 该阶段胚层向植物极逐渐下包、扩展，细胞边缘增厚向胚胎内卷形成胚环(隐约可见)，此时下包到卵黄囊的1/3处，进入原肠早期(图2I)；胚层下包到卵黄囊的1/2处，出现胚盾，为原肠中期(图2J)；胚层下包达卵径3/5时，胚体呈椭圆形，进入原肠晚期(图2K)。

2.2.5 神经胚阶段 胚层下包达卵径4/5左右时，卵黄囊被大部分包围，在末端漏出的一小部分为卵黄栓，胚盾前端稍膨大，背部中央出现神经沟，进入神经胚期(图2L)；卵黄被完全包围，胚孔闭全，为胚孔封闭期(图2M)。

2.2.6 器官形成阶段 受精15 h后，胚体中部出现2～3对肌节，为肌节出现期(图2N)；随后肌节增加至6～8节，在头部两侧出现椭圆形的眼囊，胚体包围卵黄囊约3/5，进入眼囊期(图2O)；胚体继续伸长，在卵黄囊下方出现尾芽，进入尾芽期(图2P)；胚体表面可见点状黑色素分布完全，在脑的耳后方出现耳囊，进入耳囊期(图2Q)；尾芽伸长，胚体中、后端肌节带动尾芽扭动，进入肌肉效应期(图2R)；点状黑色素在胚体表面变为星芒状，围心腔在头部与卵黄囊间可见心脏原基出现微弱的颤动，为心脏搏动期(图2S)。

2.2.7 出膜阶段 卵膜内的胚体不断翻滚或旋转，剧烈扭动，同时可见全身血液流动，多数仔鱼以头部撞破卵膜孵出，也有一部分以尾部先破膜而出；初孵仔鱼躯干透明，头部、眼部及卵黄囊表面均有黑色素分布，卵黄囊约占鱼体体积的3/4，且紧贴腹部，只能作间歇性上升旋转运动(图2T)。

2.3 全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜仔幼鱼生长比较

2.3.1 仔幼鱼全长和体质量的比较 从表2可见：全长为(1.10±0.18)cm、体质量为(0.02±0.01)g的自交翘嘴鳜经过40 d的养殖，全长为(7.13±1.53)cm，体质量为(5.13±3.50)g；而全长为(1.14±0.13)cm、体质量为(0.03±0.01)g的全雌翘嘴鳜经过40 d的养殖，全长为(8.13±0.48)cm，体质量为(6.97±1.12)g；各日龄全雌翘嘴鳜仔幼鱼的全长、体质量均大于自交翘嘴鳜，但仅在21、28、50日龄时，二者的全长、体质量存在显著性差异(P<0.05)。

A—胚盘期;B—2 细胞期;C—4 细胞期;D—16细胞期;E—多细胞期;F—囊胚早期;G—囊胚中期;H—囊胚晚期;I—原肠早期;J—原肠中期;K—原肠晚期;L—神经胚期;M—胚孔封闭期;N—肌节出现期;O—眼囊期;P—尾芽期;Q—耳囊期;R—肌肉效应期;S—心脏搏动期;T—出膜期。A—germinal stage;B—2-cell stage;C—4-cell stage;D—16-cell stage;E—multicellular stage;F—early blastula;G—mid-blastula;H—late blastula;I—early gastrula;J—mid gastrula;K—late gastrula;L—neuroblastic stage;M—blastopore closing period;N—sarcomere appearance;O—eye vesicle stage;P—tail bud stage;Q—ear vesicle stage;R—myomere period;S—heart beating period;T—hatching stage.图2 全雌翘嘴鳜的胚胎发育过程Fig.2 Embryonic development process of the all-female mandarin fish Siniperca chuatsi

表2 全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜仔幼鱼的全长和体质量Tab.2 Total length and body mass of all-female mandarin fish Siniperca chuatsi and self-bred mandarin fish larvae and juveniles

2.3.2 仔幼鱼生长特征的比较 各日龄全雌翘嘴鳜和自交翘嘴鳜的实测全长(L)与体质量(W)散点分布见图3，体质量与全长的拟合方程分别为

图3 全雌翘嘴鳜和自交翘嘴鳜仔幼鱼的体质量-全长生长关系Fig.3 Relationship between body mass and total-length of all-female and self-bred mandarin fish Siniperca chuatsi larvae and juveniles

W全雌鳜=0.016L2.971(R2=0.991,n=350)，

W自交鳜=0.020L3.008(R2=0.991,n=350)。

全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜体质量-全长生长方程差异明显，全雌翘嘴鳜b值接近于3，略呈匀速生长；自交翘嘴鳜b值大于3，体质量生长快于全长生长，呈异速生长。

3 讨论

3.1 翘嘴鳜胚胎发育特征

本研究中，全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的胚胎发育时序无显著性差异，全雌翘嘴鳜的母本与自交翘嘴鳜的母本均为正常翘嘴鳜的卵细胞，父本是经过性类固醇激素诱导后的伪雄翘嘴鳜(XX Δ♂)，全雌翘嘴鳜受精卵孵化出膜的时间比自交翘嘴鳜仅晚约0.5 h，胚胎发育速度几乎一致，这与夏仕玲等[16]报道的鱼类卵细胞质对胚胎发育速度起主要调控作用的研究结果相似，并将此称为“偏母遗传”现象；宓国强等[17]报道，斑鳜(♀)×翘嘴鳜(♂)杂交子一代胚胎发育特征也与母本保持一致。对其他翘嘴鳜的胚胎发育研究表明，孵化水温是影响受精卵胚胎发育的关键因素之一，在水温为18～30 ℃时，水温越高，胚胎发育时间越短。此外，鳜属中翘嘴鳜、斑鳜、大眼鳜在相近水温条件下孵化，胚胎发育时间差异极大，其中，斑鳜的胚胎发育时间最长，翘嘴鳜最短[11-14]，这可能是3种鳜经过长期自然选择的结果，翘嘴鳜胚胎发育时间最短、生长快、抗逆性弱，斑鳜胚胎发育时间最长、生长慢、抗逆性强。因此，国内众多学者多聚焦翘嘴鳜与斑鳜杂交的研究[12-13]，还培育出了“长珠杂交鳜”这一新品种。

笔者将鳜属与国内同科石斑鱼属鱼类的胚胎发育进行比较发现，石斑鱼属受精卵卵径比鳜属鱼类卵径要小，即使在孵化水温比鳜属鱼类低的条件下，胚胎发育的时间仍然比鳜属短，这种现象与Bobe等[18]的研究结果相同，即鱼的卵径越大，胚胎发育速度越慢。此外，鱼类胚胎发育速度还与众多的影响因素相关，如鱼的种类、水质、溶氧等。表3所示石斑鱼均为二倍体鱼，染色体数量均为48条[19]，这与翘嘴鳜的染色体数量相同[20]。此外，有研究报道，染色体数量均为48条的团头鲂Megalobramaamblycephala(♀)×蒙古鲌Erythrocultermongolicus(♂)杂交后代早期存活率达到88.6%，且食性偏向于以团头鲂为母本的草食性[21]，这不仅说明石斑鱼与鳜存在远缘杂交的可能性，而且为翘嘴鳜必须以活鱼虾作为开口饵料的难题提供了解决思路，但还需进一步的观察研究。

表3 鮨科鳜属与石斑鱼属鱼类胚胎发育比较Tab.3 Comparison of embryonic development between mandarin fish Siniperca and grouper Epinephelus in Serranidae

3.2 翘嘴鳜仔幼鱼的生长特征

本研究中对全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜仔幼鱼阶段生长特征的研究表明，全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜在仔鱼阶段生长差异不明显，16日龄时全雌翘嘴鳜仔鱼全长为(1.61±0.22)cm，自交翘嘴鳜仔鱼全长为(1.55±0.13)cm，与许淼洋等[33]报道斑鳜(♀)×翘嘴鳜(♂)杂交子一代16日龄时仔鱼全长为(1.76±0.43)cm的结果相近，与宫民等[14]报道15～17日龄时鳜仔鱼体长为1.50～1.60 cm的结果相似。16日龄以后，全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜仔鱼生长速度加快，这与西江鲤Cyprinuscarpio仔稚鱼[34]生长特征类似。鱼类性别二态性生长差异主要与能量的获取和分配相关[35]，性腺发育在能量分配中所占比例较大，性腺分泌性类固醇激素进一步影响鱼类的生长。鱼类生长的影响因素较多，如食物获取量、密度、水温、水体大小和溶氧等环境因子，具体的关键影响因素还需进一步地观察研究。

近年来，国内外众多学者把多种非线性生长模型用于动物生长过程研究[36-37]，鱼类中常用Logistic、von Bertalanffy和W=aLb3类。本研究中，对鳜仔幼鱼阶段的研究显示，全雌翘嘴鳜略呈匀速生长，自交翘嘴鳜呈异速生长。这一结果与对达氏鳇Husodauricus[38]、虹鳟Oncorhynchusmykiss三倍体幼鱼[39]和斑点叉尾鮰Ictaluruspunetatus[40]生长特性的研究结果存在差异，这可能与不同品种的生长特性有关，还与水温、水质、水体大小等环境相关。根据全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜的生长特性，在实际生产养殖中，应该充分利用这一阶段的生长特征，使用科学合理的投喂养殖策略促进其快速生长，并降低饵料系数。

4 结论

1)在水温为26～28 ℃条件下，全雌翘嘴鳜、自交翘嘴鳜的受精卵从受精到孵化出膜所需的总时间分别为39 h 12 min、38 h 44 min，各时期二者的胚胎发育特征无明显差异。

2)在仔幼鱼生长阶段，21日龄后全雌翘嘴鳜的生长速度显著快于自交翘嘴鳜。

3)在仔幼鱼阶段，全雌翘嘴鳜略呈匀速生长，而自交翘嘴鳜呈异速生长，体质量生长快于全长生长。

4)根据本研究中全雌翘嘴鳜与自交翘嘴鳜仔幼鱼阶段的生长特性，在实际生产养殖中，可以充分利用这一阶段的生长特征，使用科学合理的投喂养殖策略促进其快速生长并降低饵料系数。