唐氏综合征胎儿羊水外泌体miRNA差异表达谱分析

唐氏综合征（DS）又名21三体综合征，是最常见的出生缺陷疾病之一，其在活产婴儿中的发病率约为1/1000～1/1100，临床表现为特殊面容和轻度至中度的智力障碍，部分患者合并先天性心脏病、儿童白血病、胃肠道畸形等。此外，几乎所有的DS患者在30多岁时其神经系统还会出现阿尔兹海默样病变，并最终发展为早发性老年痴呆。

羊水是指羊膜腔内包围胎儿的液体，为胎儿提供物理保护和营养来源。在不同胎龄时，羊水的组成是动态的，内含许多重要的生物分子，如胎儿脱落细胞、DNA、RNA和代谢产物，可反映胎儿自身的发育情况。临床上正是通过遗传学分析羊水中的胎儿脱落细胞，以此判断胎儿是否罹患DS。然而，羊水中miRNA在DS胎儿发育中的作用却很少受到关注。

外泌体是由多种细胞分泌的40～100 nm的膜性小囊泡，由细胞内多泡体出芽形成，再与细胞膜融合后释放至细胞外基质中。羊水中游离的miRNA可选择性组装到外泌体中，外泌体通过未角化的胎儿皮肤从羊水传递到胎儿，在细胞通讯中发挥重要作用。Sun等采用芯片技术检测妊娠13、15、17 d的小鼠羊水中miRNA表达情况，结果发现与妊娠13、15 d小鼠相比，妊娠17 d小鼠羊水中有162个miRNA表达上调、71个miRNA表达下调，对差异表达的miRNA进行靶基因预测以及靶基因GO分析和KEGG分析，发现最富集的生物学过程和信号通路都与神经系统发育有关。提示羊水外泌体miRNA参与调控胎儿神经系统发育。孕中期正是胎儿神经元发育的活跃阶段，而DS最主要的表型就是先天智力低下，但羊水外泌体miRNA在DS胎儿发育中的变化和作用，目前为止国内外尚无相关报道。由此我们推测：在DS胎儿发育中期，羊水外泌体miRNA表达谱异常，miRNA通过调控相关基因的表达，在DS胎儿神经系统异常发育中起重要作用。

参考文献[3-6]的配方和工艺略加修改，最终确定麻辣牛肉丁的配方(见表1)：精盐2.5%，鸡精1.4%，白糖1.5%，花椒1.5%，酱油1%，料酒1%，复合磷酸盐0.4%，五香粉0.5%，味精1%，辣椒粉3.5%。

为此，本研究拟首先观察DS胎儿和正常胎儿羊水外泌体中miRNA表达谱变化并对差异表达miRNA进行生物信息学分析，然后采用实时定量PCR技术验证miRNA，最后采用双荧光素酶实验验证miRNA和靶基因的调控关系，为进一步研究DS的发病机制提供新思路。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2021年3月～2021年5月于贵州省产前诊断分中心进行产前诊断的孕妇。纳入标准：单胎妊娠，首次妊娠，无创高危，孕周（18～23），无其他身体疾病，本研究经贵阳市妇幼保健院伦理委员会批准且所有参与者均已签署知情同意书。排除标准：通过辅助生殖手段受孕者；不良孕产史；合并恶性肿瘤、重度高血压、糖尿病及慢性心脑血管病。经羊水穿刺、羊水细胞培养-染色体显带技术证实胎儿为正常整倍体的20例、为DS的20例，两组孕妇基本情况见表1。

1.2 方法

1.2.1 羊水外泌体的分离 于超净台中将留取的DS胎儿羊水及对照组羊水25 mL分别加入到50 mL的离心管中，300 g，4 ℃离心10 min，取上清，2000，4 ℃离心10 min，留上清，10 000，4 ℃离心30 min，取上清，100 000，4 ℃离心70 min，取透明沉淀，并用200 μL的PBS重悬，所得即为外泌体溶液。

1.2.3 外泌体miRNA测序 使用miRNeasy Micro Kit（Qiagen）提取外泌体总RNA。小RNA测序文库制备采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina）试剂盒。文库制备工作完成后，对构建好的文库使用Illumina Hiseq2000/2500进行测序，测序读长为单端1×50 bp。对测序原始数据产出进行过滤得到Valid数据，并对Valid数据进行进一步的miRNA比对鉴定。

通过TargetScan、miRanda两种软件，对差异表达的miRNA进行靶基因预测，两种软件同时预测到的靶基因有9477个。经过对靶基因筛选，发现这些miRNA都能靶向DS关键区段上的基因（表3）。GO分析发现富集的靶基因主要定位在膜、细胞核、细胞质、内质网膜、线粒体、高尔基体、胞内囊泡，主要功能与蛋白结合、蛋白转运、ATP结合、转移酶活性、突触等有关（图2A）；Pathway通路分析发现富集相对显著的功能通路主要为癌症、轴突导向、鞘脂信号通路、Ras信号通路、p53信号通路、自噬等（图2B）。

BACH1 3'UTR-NC+let-7d-5p、BACH1 3'UTR-WT+let-7d-5p-NC、BACH1 3′UTR-WT+let-7d-5p、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）+let-7d-5p-NC、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）+let-7d-5p，各转染组质粒转染量分别为：3'UTR 荧光素酶质粒0.2 μg、miRNA 质粒终浓度100 nmol/L，具体操作按lipofectamine2000转染试剂说明书进行。细胞转染48 h 后按Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书进行荧光素酶活性检测。

1.2.2.2 ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体浓度粒径 去离子水清洗样本池，聚苯乙烯微球（110 nm）校准仪器，用1×PBS buffer 清洗样本池后上机（Particle Metrix，ZetaView PMX 110）检测。

测序结果显示，DS组与对照组存在15个差异表达的miRNA。其中7个miRNA上调，包括：miR-329-3p、PC-3p-58054、miR-30a-5p、miR-877-5p、miR-361-5p、miR-323a-3p、miR-363-3p；8 个miRNA 表达下调，包括：miR-140-3p、let-7d-5p、PC-5p-15468、PC-5p-155238、PC-3p-119358、PC-5p-93415、PC-3p-22218、mir-4512-p3（表2）。

前几天，我和几个同学聚会，十多年未见面了，大家都异常兴奋，在茶香氤氲的包间里，彼此亲切地询问着对方的近况。多年不见，昔日青涩懵懂的学友，如今都已成熟睿智，我们谈起了各自的生活，都想从别人那里寻找一些幸福感。

3.口腔内的创面没有愈合，饮酒是会出现疼痛的，这是常人不愿意忍受的。因此，咬伤后每天喝酒不一定是符合事实的。

1.2.4 生物信息学分析靶基因 使用TargetScan、miRanda两款软件对显著性差异的miRNA分别进行靶基因预测。使用R包clusterProfiler对靶基因进行功能分析（GO）和信号通路分析，通过统计分析计算其中最为显著的靶基因。≤0.05作为显著靶基因的阈值。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据均采用均数±标准差表示，两组样本均数比较采用两个独立样本的检验，以＜0.05 表示差异有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

1.2.6 通过双荧光报告基因系统检测let-7d-5p 对BACH1的抑制作用 采用生物信息学软件预测let-7d-5p可能调控的靶基因，筛选并评估let-7d-5p 靶向调控BACH1 的可能性。从Pubmed 基因库中获取人BACH1基因3'UTR序列（NM_001186.4），设计并化学合成涵盖let-7d-5p作用位点的BACH1基因3'UTR野生型与突变型片段，BACH1-3'UTR-WT 与let-7d-5p结合位点进行点突变处理即为BACH1-3'UTR（MUT1+MUT2）基因片段。用 于BACH1-3'UTR-WT 与BACH1-3'UTR（MUT1+MUT2）基因片段PCR扩增的引物为BACH1-Fp：5'-GAGGAGTTGTGTTTGTGG AC-3'；BACH1-Rp：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'，PCR 产物两端分别为MluI 及HindIII 酶切位点。BACH1基因3'UTR 野生型与突变型片段扩增产物经双酶切鉴定，与H306 双荧光素酶报告载体进行酶连接。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α，挑选阳性克隆菌落进行双酶切鉴定及测序。鉴定正确的BACH1基因3'UTR野生型与突变型重组双荧光素酶基因报告载体命名为BACH1 3'UTR（WT）及BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）。制备对数生长期293T细胞悬液，将细胞按70%的汇合度接种到96孔板，将3'UTR双荧光素酶质粒（BACH1 3'UTR-NC、BACH1 3'UTRWT、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2））与miRNA质粒（let-7d-5p、let-7d-5p-NC）两两组合共转染293T细胞，形成6个共转染组：BACH1 3'UTR-NC+let-7d-5p-NC、

1.2.2.1 醋酸双氧铀负染透射电镜观察外泌体形态 将提取的外泌体样本从-80 ℃冰箱取出后置放于冰盒中，溶解后稍离心，使用移液枪吸取15 μL的外泌体样本于铜网上静置1 min。使用滤纸将铜网上的外泌体样本吸干，然后使用移液枪吸取15 μL的2%醋酸双氧铀染色液室温染色1 min。使用滤纸将铜网上的外泌体样本吸干，将染色完成的样本放于灯下烤10 min，于透射电镜（FEI，G2 spititi）观察拍照，保存图片。

1.2.5 qPCR验证测序结果 挑选3个靶向DS关键区域基因最多的miRNA 进行qPCR 验证。分离羊水外泌体、提取RNA，对目的miRNA设计引物、探针，以rRNAU6 为内参，序列如下:miR-140-3p-F：ACGACCACA GGGTAGAACC，miR-140-3p-R：TTCGCACTGGAT ACGACGTCCGT；let-7d-5p-F：AAGGCGGAGAGGT AGTAGG，let-7d-5p-R：TTCGCACTGGATACGAC AACTATGCA；mir-4512-p3-F：CCGCCTCACTGTGT CG，mir-4512-p3-R：TTCGCACTGGATACGACGCC TG；U6-S：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-A：AACG CTTCACGAATTTGCGT。上样体系：cDNA3 μL，qPCR Buffer 10 μL，Primer Mix（2 μmol/L）2 μL，ddHO 5 μL。反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃、5 s；58 ℃，30 s；50 个循环。采用ΔΔCt 方法对miR-140-3p、let-7d-5p、miR-4512 表达水平定量分析。

2 结果

2.1 羊水外泌体鉴定

透射电镜下可见两组羊水外泌体直径在30～200 nm之间，呈圆形或椭圆形的囊泡状结构（图1A），ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪显示羊水外泌体粒径分布峰值为143.1 nm（图1B），符合外泌体形态特征。Western blotting检测两组羊水外泌体标志蛋白，结果发现两组羊水外泌体均表达CD9、CD63、HSP70、TSG101，且表达水平一致（图1C）。

隧洞混凝土由混凝土拌和系统拌制混凝土，混凝土由混凝土罐车运输，混凝土泵输送混凝土入仓，分层铺料。侧墙顶拱采用边挂模板边浇筑。底板混凝土浇筑直接入仓，软轴振捣器振捣，人工找平收面。

2.2 两组羊水外泌体miRNA差异表达情况

1.2.2.3 外泌体标志蛋白的检测 按照BCA蛋白测定试剂盒（Pierce BCA Protein assay Kit，Thermo）说明书提取外泌体总蛋白。取80µg总蛋白上样，行SDS-PAGE（12%），电泳结束后转移蛋白至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭90 min，分别加入Anti-CD9（abcam，1∶1000）抗体、Anti-HSP70（SANTA，SC-24，1∶500）抗体、Anti-CD63（abcam，1∶1000）抗体、Anti-TSG101（abcam，Ab125011，1∶1000）抗体，4 ℃摇床孵育过夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（碧云天1∶4 000），室温孵育90 min，TBST 洗膜3 次，ECL（Share-bio，SB-WB011）发光成像。用Image Lab图像分析软件对每个条带灰度值进行定量分析。

2.3 生物信息学分析靶基因

1.2.2 羊水外泌体的鉴定

2.4 qPCR验证测序结果

DS 组miR-140-3p、let-7d-5p 较对照组显著降低（＜0.05），与测序结果一致。miR-4512较对照组显著增加（＜0.05），与测序结果相反（图3）。

范冰冰的出道，源于参演一部叫《女强人》的电视剧。当年只有15岁的她，只参与拍摄了三天的戏。放在今天，也就是跑龙套的。但范冰冰的演艺经历赫然写着：1996年，范冰冰参与拍摄刘雪华与邵兵主演的电视剧《女强人》。这就像在北京的打工仔，称自己参与首都建设差不多。不出名时可以理解，出了名还这样做，说明这三天短暂的拍摄对她之后的演艺事业足够重要。

2.5 双荧光素酶报告基因检测结果

质粒共转染293T细胞48 h后，荧光素酶活性检测结果如图4显示：let-7d-5p对空载体几乎没有作用；和空载组相比，let-7d-5p可以调控BACH1 带有3'UTR的luciferase的表达（＜0.001），下降62.08%；而在结合位点突变后，这种调控关系明显减弱（＜0.001），回升33.75%。

3 讨论

本研究首次分析DS胎儿和正常胎儿羊水外泌体中miRNA表达谱，探索在DS胎儿发育过程中可能起调控作用的外泌体miRNA。测序结果显示，与正常胎儿相比，DS 胎儿羊水外泌体miRNA 表达谱发生改变。Xie等应用芯片技术发现，与健康对照组相比，先天性梗阻性肾病胎儿的羊水外泌体中miR-300和miR-299-5p表达降低，且这两个miRNA的靶基因主要参与Wnt信号通路，而Wnt信号通路已证实与肾纤维化有关，提示miR-300和miR-299-5p可能是先天性梗阻性肾病产前诊断的生物标志物。由于外泌体源性的miRNA比细胞中普遍存在的miRNA更为稳定，提示本研究中观察到的差异表达的羊水外泌体miRNA可能是DS产前诊断新的标记物。

大部分农村目前都已经修建了村村通的公路，加之当下种类多样的交通工具，交通十分快速便捷。以平原地区来说，在5平方公里左右的范围内设立一个村镇是可以满足农业生产的需求的。而在山区当中的这个范围可以缩至1.5平方公里的范围左右。当前我国乡村当中，大部分新乡镇的人口都不低于千人，甚至人口较多的，会在1万人或万人往上。在这样的人口密度的情况下，村镇居民进行集中居住，有利于扩大村镇居民的活动范围，增加村镇居民的信息量，促进居民间的来往，这正是农业生产逐渐趋向于集约化以及专业化所需要的。而集中居住的另一个好处是能够是农业发展往市场农业和产业农业的方向转变，是农业发展多元化，促进新农村的生产力。

我们对差异表达的miRNA进行靶基因筛选，发现差异表达的miRNA或多或少都能靶向DS关键区段上的基因，与DS表型息息相关。进一步对靶基因进行GO分析，发现主要定位在膜、细胞核、细胞质、内质网膜、线粒体、高尔基体、胞内囊泡，主要功能与蛋白结合、蛋白转运、ATP结合、转移酶活性、突触等有关。从靶基因在各种细胞器膜和胞内囊泡定位的情况看，这些miRNA可能与羊水外泌体的形成和释放有关。此外，还有一个不能忽略的功能类别——突触，“突触”是一个神经元的冲动传到另一个神经元或传到另一细胞间的相互接触的结构，而DS患者的突触数量明显减少，由此推测DS 患者在胎儿期，其突触发育可能异常。Pathway分析发现富集相对显著的通路主要为癌症、轴突导向、鞘脂信号通路、Ras信号通路、p53信号通路、自噬等。值得注意的是，其中部分通路已证实与神经系统发育有着密切的联系，例如：轴突导向和Ras 信号通路。轴突导向是指在神经系统发育过程中，神经元的轴突只有精确的抵达其目标位置才能形成具有正常生理功能的神经网络。在神经发育过程中，轴突生长导向分子可与受体形成复合物，引导神经突起生长的方向，但当缺乏轴突生长导向分子时，位于DS关键区段的唐氏综合征细胞粘附分子可和受体形成受体复合物，该复合物通过激活Ras信号通路引起细胞骨架蛋白系统的重组，从而介导轴突生长锥生长，但在DS患者中，由于多了1条21号染色体，导致DS关键区段上的唐氏综合征细胞粘附分子的过度表达，从而扰乱轴突导向，最终导致DS患者神经网络异常。

测序技术的引入促使miRNA研究领域进入快速发展阶段，但该技术只适合初筛，后续还需可靠性更好的qPCR技术验证。我们采用qPCR对靶向DS关键区段最多的3 个miRNA 进行验证。结果发现DS 组中miR-140-3p、let-7d-5p表达较对照组降低，与测序结果一致，而miR-4512表达较对照组增加，与测序结果相反。分析原因可能是没有用同一批样品进行两种实验，同类型样本进行的验证差异原因主要是个体之间的差异，特别是异质性非常高的疾病。

康复护理通过全程的心理干预，扭转患者的消极、负面情绪，提高患者的康复能动性及自我效能感，为康复训练奠定了坚固的思想基础；通过饮食干预与血糖监测，在积极控制血糖水平的同时促进患者搭建科学、合理的糖尿病饮食结构，为患者血糖的长期控制提供了方法与指导，促使患者以“五架马车”并行模式进行糖尿病的有效控制；通过专业的按摩手法，刺激患者患肢肢体感觉，加速局部血液循环，改善神经功能，根据患者具体病情及自理能力进行科学有效、循序渐进的康复运动，最大程度上恢复患者的肢体功能。

本研究通过生物信息学分析发现let-7d-5p 与BACH1 mRNA 3′UTR有两个结合位点，且预测评分较高，表明let-7d-5p对BACH1可能存在靶向调控作用。BACH1位于21号染色体，是碱性亮氨酸拉链（bZIP）和CNC转录因子家族成员。作为一种负转录调节因子，BACH1能与DNA的抗氧化反应元件结合，从而抑制包括血红素加氧酶-1（HO-1）在内的参与氧化应激反应的抗氧化基因的转录。有研究发现BACH1在DS患者脑皮质中的表达上调，抑制抗氧化基因HO-1的表达，使其无法发挥神经保护功能，从而增强氧化应激，加重脑组织损伤。此外，Ferrando等在DS胎儿大脑皮质中发现，由21 号染色体编码的4 种蛋白质（BACH1、ERG、RUNX1、SIM2）中只有BACH1显著表达，但此时的抗氧化基因HO-1的表达也是增加的，它还没有受到BACH1的抑制，表明DS患者在胎儿期其大脑就已发生氧化应激事件。本研究通过双荧光素酶报告基因法证实let-7d-5p可靶向作用于BACH1。结合let-7d-5p在DS胎儿羊水中的表达情况，我们推测DS胎儿脑组织中BACH1表达上调，可能与羊水外泌体中携带的let-7d-5p有关，但具体机制如何，尚需进一步研究。

综上，本研究发现DS胎儿与正常胎儿羊水外泌体miRNA表达谱存在差异。羊水外泌体let-7d-5p可能通过调控BACH1的表达促进DS胎儿大脑氧化应激，这对进一步阐明该疾病的发病机制具有重要的参考意义。