结香多糖的提取工艺

陈银华， 吴华芬， 曹鹏飞， 周斌雄， 徐伟忠

(丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000)

结香(EdgeworthiachrysanthaLindl．)别名黄花结香，是瑞香科结香属植物，始载于《群芳谱》，主要分布在东亚地区，我国陕西、江苏、安徽、浙江、江西、河南等地都有栽培，湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等省区亦有种植[1]。结香一般种植在海拔400～1 000 m的地区[2]，只要土壤条件良好，结香生长状况无显著差异。徐小牛等[3]调查发现，结香适生于疏松肥沃、排水良好的微酸性至中性的砂质土壤。结香味甘、性温，归肾、肝经，其根、茎、花可分别入药，根和茎具有舒筋活络，消肿止痛功效；花具有养阴安神、明目、祛障翁的功效[1,4]。随着研究的深入，结香品质和药效问题日益受到世人重视。越来越多的科研人员对结香的化学成分及药理作用进行研究，为进一步研究和开发利用这种植物资源提供参考。日本学者发现，用结香花研制杀虫药效果较好[5]。Ohigashi等[6]报道了结香植物成分可诱发EB病毒的活性。Walter等[7]发现，结香的根能用来治疗毒蛇咬伤。此外，结香中所含有的丁香甙具有抗疲劳、抑郁，提高脑部血液循环、性能力，抑制葡萄糖代谢等其他生理活性[8-9]。王淑芳等[10]报道结香中含有的结香苷C、紫云英苷和芦丁等化合物还具有抗凝血、抗菌、抗炎和抗氧化作用，可以用于治疗糖尿病、血管硬化和视网膜炎，可见结香全身是宝，对于研究结香化学物质的提取有重要的意义。

多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，是自然界含量丰富的天然大分子物质之一，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起着至关重要的作用，和蛋白质、核酸、脂类构成了最基本的4类生命物质。结香含有丰富的VA、VB、VC以及铁、钾、锌、钙等微量元素。目前，国内外对结香化学成分的研究报道不多，从本次实验以及查阅的文献[5,9]来看，结香中含有大量多糖成分，其生理活性具有植物生长调节、抗菌抗病毒、松弛平滑肌、抗凝血等作用。因此，对于结香多糖提取工艺的研究具有重要的意义。

目前，植物多糖的提取方法较多，主要有水提法、碱提法、酸提法、酶法、超滤法、超声提取、CO2超临界萃取等[11]。其中，热水提取法是一种比较通用的方法，因其提取工艺简单、生产成本低而受到广泛使用。有关结香多糖提取工艺条件的优化鲜见报道，本研究以结香花为材料，以多糖提取率为考察指标，在单因素条件下研究料液比、浸提时间、浸提温度和醇沉比对多糖提取的影响，再通过二次正交旋转实验法选出结香多糖提取的最佳提取工艺，为结香的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

实验所用的材料为结香花，2018年3月采自遂昌县高坪乡茶树坪村，60～80 ℃烘干，磨成粉末备用。

1.1.2 仪器

Scout SL电子天平(上海申安医疗器械厂)；HHS型电热恒温水浴箱(上海博迅实业有限公司)；TDL240B离心机(太仓市实验设备厂)；DHG29053BS2Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；723C可见分光光度计(上海优浦科学仪器有限公司)。

1.1.3 试剂

5%苯酚、95%乙醇、95%浓硫酸，以上试剂均为分析纯。

1.2 结香多糖的提取工艺流程

称取预处理后的结香花的粉末0.5 g分别放入5个100 mL锥形瓶→加水(蒸馏水)浸提→4 000 r·min-1离心10 min，取上清液放入锥形瓶→加95%乙醇→4 ℃静置22 h过夜→10 000 r·min-1离心10 min，取沉淀物(粗多糖)→溶于水搅拌混匀→测定结香多糖含量。

1.3 苯酚-硫酸比色法测定多糖含量

1.3.1 葡萄糖标准品溶液的配制

精确称取105 ℃干燥恒重的标准葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，得浓度为1 mg·mL-1的葡萄糖贮备液。准确移取葡萄糖贮备液10 mL，用蒸馏水定容至100 mL，得0.1 mg·mL-1的葡萄糖使用液。

1.3.2 标准曲线的绘制

分别取上述0.1 mg·mL-1的葡萄糖使用液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6支10 mL试管中，加蒸馏水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀后迅速加入5.0 mL浓硫酸，室温下放置30 min。另以2.0 mL蒸馏水作为空白对照，所有操作均与上述相同，测定490 nm下吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，其相应的吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。得标准曲线回归方程为Y=7.348 6X-0.098 7(R2=0.978 5)。

1.3.3 多糖含量与提取率的测定

在粗多糖样品中加入10 mL蒸馏水，使多糖完全溶解在蒸馏水中。用移液枪精密吸取样品液100 μL，于490 nm下测定吸光度，从标准曲线中求样品粗多糖的含量。

1.4 结香多糖提取工艺单因素实验

1.4.1 浸提固液比的选择

称取5份均为0.5 g的结香粉末，先置于5个洁净的锥形瓶中，再按固液比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 g·mL-1加入蒸馏水，标记好置于80 ℃水浴锅中浸提3 h。浸提之后将浸提液在4 000 r·min-1下离心10 min，将上清液按醇沉比3∶1放入4 ℃冰箱醇沉22 h后，在相同转速条件下离心10 min，弃上清，溶于10 mL蒸馏水中，精密吸取样品液100 μL于490 nm下测定吸光度，并从标准曲线中求得样品粗多糖的含量。

1.4.2 浸提温度的选择

在其他参数保持不变的情况下(结香花粉末0.5 g、固液比40∶1 g·mL-1)分别在60、70、80、90和100 ℃下浸提3 h，再把浸提液离心10 min，取上清液，加入3∶1的醇沉比在4 ℃冰箱中醇沉22 h，4 000 r·min-1下离心10 min，得粗多糖。将粗多糖溶于10 mL蒸馏水中，精密吸取样品液100 μL于490 nm下测定吸光度，并从标准曲线中求得样品粗多糖的含量。

1.4.3 浸提时间的选择

称取5份结香花粉末，每份0.5 g，浸提时间分别为1、2、3、4和5 h，放入95 ℃水浴锅中(其他条件同上)进行浸提，浸提后的提取液用3倍体积的无水乙醇进行沉淀，在4 ℃冰箱中醇沉22 h，4 000 r·min-1下离心10 min，得粗多糖。将粗多糖溶于10 mL蒸馏水中，精密吸取样品液100 μL于490 nm下测定吸光度，测量求出提取率以比较不同时间对结香多糖的影响。

1.4.4 浸提醇沉比的选择

在固液比40∶1 g·mL-1，温度80 ℃下浸提3 h，浸提液离心后将所得的上清液分别按醇沉比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1放入4 ℃冰箱醇沉22 h，4 000 r·min-1下离心10 min，得粗多糖，将粗多糖溶于10 mL蒸馏水中，精密吸取样品液100 μL于490 nm下测定吸光度，并从标准曲线中求得样品粗多糖的含量。

1.5 二次正交旋转组合设计实验

依据单因素实验的结果，确定因素编码水平范围，以多糖提取率为指标，以料液比、浸提温度、浸提时间、浸提醇沉比为考察因素，进行4因素5水平(全实施)二次正交旋转组合实验。

1.6 数据处理

实验中各处理的多糖含量通过方差分析和多重比较，确定处理间的差异。所有数据分析均用DPS数据处理系统软件完成[12]。

2 结果与分析

2.1 单因素

2.1.1 料液比

在浸提温度为80 ℃，浸提时间为3 h，醇沉比1∶3的条件下，研究料液比对结香花多糖提取效率的影响，实验结果如图1所示。在料液比为1∶20～1∶40 g·mL-1时，多糖的含量呈增加趋势，增加明显，在料液比为1∶40 g·mL-1时，多糖含量达到最大值，可达到12.22 mg·g-1。但随着料液比的继续减小，多糖的提取效率大幅度下降，在料液比达到1∶50 g·mL-1时，随着料液比减小下降趋势逐渐平缓。这是因为加水量越多，样品在溶液中的分散度越大，接触面积也越大，有利于提取。但当加水量达到一定程度后，再增加水量时，多糖提取率却大幅度下降，可能是多余的提取剂也可以破坏结香细胞，使得细胞膜受到损害，造成细胞液或者其他的成分溶出，这样溶液的颜色会发生改变而致使测定结果降低。显然随着料液比的减小，提取多糖的成本也会相应的增大，因为水的比例过大，增加了浓缩处理的工作量和能耗，不利于实际操作和生产[13]，因此，结香花多糖提取的料液比在1∶40 g·mL-1为宜。

图1 料液比对结香多糖提取率的影响

2.1.2 浸提温度

在料液比为1∶40 g·mL-1，醇沉比1∶3，浸提时间为3 h的条件下，研究温度对结香花多糖提取效率的影响，如图2所示。在60～70 ℃，多糖的提取率基本保持相同水平。随着水浴温度的升高，分子的热运动加快，糖从结香细胞中的溶出率增加，提取含量有明显的上升趋势，而温度达到90 ℃以上时，多糖含量的增加比较缓。由于多糖是活性物质，温度过高就会破坏其结构，影响其活性，因此，提取温度以90 ℃为宜。

图2 温度对结香多糖提取率的影响

2.1.3 浸提时间

在料液比为1∶40 g·mL-1，醇沉比1∶3，浸提温度为95 ℃的条件下，研究浸提时间对多糖提取效率的影响。结果如图3所示，在前3 h内，多糖的含量呈大幅度上升趋势；而在3～4 h多糖提取率上升减缓，4 h时达到最大值15.586 1 mg·g-1，4～5 h逐渐下降。这是因为结香多糖的提取实际上是一个扩散的过程，随着时间的延长，梯度差越来越小，扩散的速度也就越来越慢，所以一定温度范围内延长提取时间有利于多糖的充分浸出。但又因为结香多糖的还原性比较强，若提取时间过长反而会被空气中的氧气氧化，使多糖的氧化加重或发生降解反应，导致提取量下降。因此，选择4 h的浸提时间为最佳。

图3 浸提时间对结香多糖提取率的影响

2.1.4 醇沉比

在料液比为1∶40 g·mL-1，浸提时间为3 h，浸提温度为80 ℃的条件下，研究醇沉比对结香多糖提取率的影响。由图4可以看出，随着乙醇与多糖浓缩液比例的增加，多糖得率呈增加趋势，当醇沉比达到5∶1后，多糖得率下降。因此，醇沉比选择5∶1时效果最佳。

图4 醇沉比对结香多糖提取率的影响

2.2 优化工艺

2.2.1 实验设计和结果

在单因素实验的基础上，针对传统单因素实验设计的缺点，以多糖提取率为指标，取料液比(X2)、温度(X3)、时间(X4)和醇沉比(X1)作为考察因素，采用了二次回归正交旋转组合设计对结香多糖提取工艺的主要影响因素进行进一步优化实验。因素+2～-2水平编码值：X1分别为4.5、4.0、3.5、3.0和2.5；X2分别为45、40、35、30和25；X3分别为100、95、90、85和80 ℃；X4分别为4.5、4.0、3.5、3.0和2.5 min。实验结果见表1。

2.2.2 二次回归方程的建立与检验

根据实验结果利用DPS统计分析软件，建立结香多糖提取率与影响因素间的二次回归模型，其回归方程为：Y=17.692 16+4.223 26X1-0.140 27X2+4.039 37X3-0.062 30X4-0.248 55X12+3.688 06X22+6.609 47X32+4.740 11X42-6.581 41X1X2+5.285 97X1X3+0.234 61X1X4+0.284 80X2X3+0.168 54X2X4-0.051 67X3X4。

经方差分析表明，回归方程的失拟性检验F1=2.798 54(P>0.05)不显著，即方程的拟合性较好；回归方程的显著性检验(F2=657.694 59，P<0.01)极显著，说明方程与实验数据的配合是可行的。方程回归结果可靠，可用于结香多糖热水提取实验的理论预测。对二次回归模型进行显著性检验，得到的一次项系数X1、X3为极显著，X2、X4不显著，表明温度、醇沉比是多糖提取率的主要影响因素，时间和料液比为次要影响因素。二次项系数当中，X22、X32、X42为极显著因素，X12不显著，X1X2、X1X3极显著，X1X4、X2X3、X2X4、X3X4不显著。

在α=0.10显著水平剔除不显著项后，得到简化后的回归方程为：Y=17.692 16+4.223 26X1+4.039 37X3-0.248 55X12+3.688 06X22+6.609 47X32+4.740 11X42-6.581 41X1X2+5.285 97X1X3。

表1 二次回归旋转组合设计及结香多糖提取结果

2.2.3 主因素效应

根据回归方程的一次项系数的绝对值来比较各个因素之间的主次关系，可得到醇沉比>温度>料液比>时间。因此，醇沉比是影响多糖提取率的最显著因素。

2.2.4 单因素效应

对单因素效应进行研究，分析X1、X2、X3、X4对结香多糖得率的影响，即固定醇沉比、料液比、温度及时间这4个影响因素中的任意3个为零，研究其中一个对多糖得率的影响。结果如图5所示，对于浸提醇沉比，从低水平到高水平，多糖提取率一直在增加。在低因素水平间，多糖提取率随着浸提温度、料液比和浸提时间的增加而下降，并在0因素水平达到最小值。在高因素水平间，多糖的提取率又随醇沉比、料液比、浸提时间的增加而增加，由此可见，醇沉比对多糖提取的影响极其显著。

图5 各因素对多糖提取率的影响

2.2.5 两因素间的互作效应

从回归系数的显著性检验可以看出，由此可直观地分析醇沉比分别对料液比和温度两因素对多糖提取率的互作效应。

从图6可以看出，在醇沉比的低水平下，多糖的提取率随料液比的减小而增加，当醇沉比慢慢增大时，随着料液比的减小，多糖提取率先降低后升高，而且下降的幅度在明显增加。当醇沉比在高水平时，随着料液比的减小，多糖的提取率则一直呈下降趋势。当料液比在高水平时，随着醇沉比的增加多糖的提取率渐渐下降，且下降的幅度越来越缓，在高水平的料液比时随着醇沉比的增加，多糖的提取率则大幅度的增加。从两个因素的共同作用可以显示，随着料液比的减小和醇沉比的增加，多糖的提取率是在渐渐减少的。考虑到实际情况，综合考虑成本问题，选择低水平的料液比，低水平的醇沉比或者着高水平的醇沉比，低水平的料液比是较合理的。

图6 料液比与醇沉比的互作效应

从图7可以看出，在高水平的醇沉比时，随着浸提温度的升高，多糖的提取率先缓慢下降，后又大幅度地升高。而当醇沉比水平减小时，随着浸提温度升高，多糖提取率的下降幅度越来越大。当醇沉比处与低水平时，随着温度的升高，多糖得率先大幅度下降后又缓慢上升。当浸提温度处于高水平时，随着醇沉比的增加多糖的得率呈直线上升趋势。而温度处于低水平时，随着醇沉比的增加多糖的得率呈缓慢的下降趋势，下降幅度非常小。从两因素的相互作用可以看出，选择高水平的浸提温度和高水平的醇沉比比较合理。

图7 浸提温度与醇沉比的互作效应

2.2.6 提取条件的优化

通过DPS软件分析，对数学回归模型分析后可得最佳提取工艺条件：醇沉比3.6∶1，料液比1∶35 g·mL-1，浸提温度90 ℃，浸提时间3.5 h，预测值为18.34 mg·g-1。

3 讨论

近年来，对多糖产品的研究开发相当热门，大量药理及临床研究证实，多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、降胆固醇等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景[14]。有关植物多糖的研究进展十分迅速，它的研究已成为糖生物学研究的一个热点。现在对于植物多糖的提取方法很多，水提法、碱提法、酸提法、酶法、超滤法、超声提取、CO2超临界萃取等[11]。而热水提取法作为目前提取多糖比较通用的方法，因其提取工艺简单、不需要特殊的设备、生产成本低适用于工业化生产而受到广泛使用。

本文采用的是热水提取法对结香多糖提取工艺进行研究，通过对浸提时间、浸提温度、料液比和醇沉比4个单因素进行研究，再通过二次正交旋转组合实验进行优化。

3.1 料液比对结香多糖提取率的影响

对于料液比这一影响因素，实验结果表明，随着料液比的减小，多糖的含量呈先增加后减少的趋势。这是因为加水量越多，样品在溶液中的分散度越大，接触面积也越大，有利于提取。但当加水量达到一定程度后，再增加水量时，多糖提取率却大幅度下降。显然随着料液比的减小，提取该多糖的成本也会相应的增大，因为水的比例过大，增加了浓缩处理的工作量和能耗，不利于实际操作和生产。如虎皮兰多糖提取工艺的优化中，最佳的料液比为1∶30 g·mL-1[15]。仙人掌多糖提取工艺研究中，最佳料液比为1∶30 g·mL-1[16]。五味子分离多糖提取工艺的研究中，最佳料液比在1∶40 g·mL-1[17]。而本实验结果也表明，料液比对结香多糖的提取有极显著影响，考虑到生产成本，最终确定最佳浸提料液比为1∶35 g·mL-1。

3.2 温度对结香多糖提取率的影响

对于浸提温度这一影响因素，多数多糖的提取率在一定温度范围内是随着温度的提高先升高后降低，因此，在选择温度时，温度不宜过低。根据文献记载的实验结果，长时间高温浸提会使部分多糖活性被破坏[18]，而不同种类的多糖也具有不一样的耐热性。如耐热性较好的豆渣[19]可在120～150 ℃进行多糖的提取，而且在这个温度水平提取率是最佳的。耐热性相对较差的枇杷叶[20]、板栗[21]、葵花籽[22]等要在30～60 ℃进行多糖的提取。而结香的耐热性也较强，在90 ℃的温度条件下提取多糖较为适宜。

3.3 时间对结香多糖提取率的影响

对浸提时间这一因素，我们知道多糖的溶解需要时间，一方面浸提的时间太短，只有表面部分的多糖溶出，材料内部需要一定的溶胀时间，然后内部的多糖才会溶出；另一方面，长时间的提取会有条件上的不稳定，增加了提取液中杂质的含量，影响多糖的活性。综合考虑多糖的提取率与能耗的问题，本文最终的实验结果选择3.5 h为最佳浸提时间。

3.4 醇沉比对结香多糖提取的影响

醇沉比对结香多糖的影响也很显著，随着醇沉比的增加，提取率先提高后又降低。出现这种结果的原因，可能随着结香多糖的溶解，已在乙醇溶液中达到饱和，到了结香多糖的最大溶解度后，随着乙醇溶液的增加不再变化了。因此，我们最后选择醇沉比为3.6∶1为结香提取的最佳值。

3.5 结香多糖提取工艺的二次正交旋转实验

二次正交旋转组合实验设计[23]是正交回归实验设计的一种，它具有实验次数较少，计算简便，且能根据预测值直接寻求最优区域的优点，经精心设计、实施的回归设计，可提供大量的信息，可以从许多角度对模型进行模拟分析，以充分发掘模型所提供的信息[24]。近年来，该法虽广泛用于农业、生物、化工等领域，取得了较好的效果，但关于结香水溶性多糖提取工艺条件的优化鲜见报道，本文通过二次正交旋转组合设计，安排4个因子作二次正交回归实验，获得结香多糖的提取率4个实验因子的正交回归模型。运用回归设计的理论和方法，通过DPS数据系统处理，最后得到醇沉比、料液比、温度、时间与多糖提取率的数学模型最终确定了最佳的提取工艺条件：醇沉比3.6∶1、料液比1∶35 g·mL-1、浸提温度90 ℃，浸提时间3.5 h，在此条件下提取的结香多糖的含量平均可达到18.34 mg·g-1，优化了结香多糖的提取工艺，得到了更为精确的参数。李昕等[25]同样在单因素实验的基础上，采用二次正交旋转组合设计方法得到白术水溶性多糖最佳提取工艺。与正交设计、均匀设计相比，二次正交旋转组合设计更有利于得到精确的参数。二次正交旋转组合设计的特点使其在需要高精准数据的实验中的地位尤为突出。