伏九贴敷药物对哮喘大鼠炎性反应及Th17/Treg漂移的拮抗作用

付 昆，杨 艳，仲 蓬，陆一菱，赵 岚，徐 敏

(1. 成都市第三人民医院/西南交通大学附属医院，四川 成都 610031；2. 重庆医科大学附属成都第二临床学院，四川 成都 610031)

哮喘是最常见的慢性炎症性疾病之一，影响着世界范围内约3.34亿人[1]。近年来全世界自我报告和医生诊断的哮喘成人患病率为4.3%，尤其在发达国家发病率更高[1]，这已经成为危害人类健康的世界性公共卫生问题之一。因此寻找效果明确、机制确切的治疗策略是临床与科研亟待解决的问题。中医药在防治哮喘方面积累了丰富的经验，中药内服和中医外治均有较好治疗效果。伏九贴敷是成都市第三人民医院开展的特色中医外治疗法，该疗法选用带有刺激性的药物如白芥子、甘遂、延胡索、细辛等贴敷于相应穴位，致使局部皮肤充血发泡，从而促进药物吸收以发挥药理效应，达到治疗目的。课题组前期就伏九贴敷药物中生、炒白芥子的不同配比对哮喘豚鼠皮肤的刺激性与抗哮喘作用相关性进行了研究，发现生白芥子和炒白芥子比例各半时，既可维持伏九贴敷的疗效，又能减轻其对皮肤的刺激[2]。本实验探讨了以该配比制作的伏九贴敷药物对哮喘大鼠炎性反应及CD4+辅助性17型T细胞(Th17)/CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)失衡的干预作用，旨在进一步明确该外治疗法的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠，体重180～220 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(川)2015-30。于动物房适应性饲养5 d，室温18～25 ℃，12 h/12 h明暗交替，自由饮水、进食。

1.2药物与试剂 醋延胡索、醋甘遂、生芥子、炒芥子、细辛均购自四川省中药饮片有限公司，批号分别为200318，190524，200506，191203，200420。将芥子(生、炒各半)、延胡索、甘遂和细辛按2∶1∶1∶1比例粉碎为100目细粉，以生姜汁调成糊状制成伏九贴敷药物备用。卵蛋白(OVA)购自Sigma公司，货号：A5253；Al(OH)3：国药集团化学试剂有限公司，批号：20161130；地塞米松磷酸钠注射液：国药集团容生制药有限公司，批号：2001202；免疫球蛋白E(IgE) ELISA 试剂盒L：Elabscience，批号：6W8LLC3DE1；白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17(IL-17) ELISA 试剂盒均来自联科生物，批号：A31001113，A38200623，A301B01033，A31701113；二甲苯、无水乙醇、中性树胶：国药集团化学试剂有限公司，货号：10023418，100092683，10004160；苏木素-伊红试剂盒：武汉谷歌生物，货号：G1005。

1.3主要仪器 PL-203型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；NE-C801压缩式雾化器[欧姆龙(大连)有限公司]；JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；RM2016型切片机(上海徕卡仪器有限公司)；Neofuge 15R高速冷冻离心机(Heal Force)；Eclipse E100正置光学显微镜(日本尼康)；DS-U3成像系统(日本尼康)；Epoch酶标仪(BioTeK)。

1.4实验方法 按照随机数字表将30只大鼠随机分为正常组、模型组、假贴敷组、伏九贴敷组和地塞米松组。于实验第1天和第7天，正常组大鼠腹腔注射生理盐水1 mL，其余各组大鼠腹腔注射1 mL含有OVA 100 mg、Al(OH)3100 mg的混合液致敏。从第15天开始，正常组大鼠给予生理盐水雾化吸入，其余组大鼠给予1% OVA雾化吸入，均每天1次，每次20 min，连续7 d。末次雾化结束后，假贴敷组和伏九贴敷组用脱毛膏对取穴部位进行脱毛，第2天取调制好的伏九贴敷药物适量，按照《实验针灸学》[3]取穴方法敷于伏九贴敷组大鼠大椎、肺俞(双侧)、肾俞(双侧)穴并用胶布固定，假贴敷组同样方法贴无药空白胶布，均每次贴敷4 h，隔日贴敷1次，共7次；地塞米松组腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg，隔日1次，共7次；正常组和模型组不做任何处理。

1.5观察指标及方法

1.5.1肺组织病理学观察 末次贴敷后24 h处死大鼠，取右肺组织固定24 h以上，依次梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制备3 μm切片，脱蜡至水，苏木素-伊红染色，脱水封片，显微镜下观察病理形态，并采集图像，参考文献[4-6]评分标准对4项主要病理改变进行评分。①支气管周围炎性浸润：几乎没有为0分；少量、分散为1分；1层浸润为2分；2～4层(圈)浸润为3分；4 层(圈)以上浸润为4分。②上皮细胞脱落：无或偶见脱落为0分；轻度脱落(稀疏、散在)为1分；中度脱落为2分；重度脱落为3分。③组织水肿：无水肿为0分；轻度弥漫性水肿为1分；中度肺泡和细支气管水肿为2分；区域性水肿为3分；肺炎样水肿为4分。④肺泡间隔增厚：间隔正常为0分；增至正常厚度的1～2倍为1分；增至正常厚度的3～5倍为2分；增至正常厚度的5倍以上为3分。

1.5.2炎性因子及细胞因子检测 末次贴敷后24 h麻醉大鼠，腹主动脉取血，4 ℃下2 000 r/min 离心(离心半径6 cm)10 min，取上清，严格遵照ELISA试剂盒操作步骤检测血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10水平。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织HE染色表现 正常组大鼠支气管黏膜上皮完整，肺泡清晰完整，间隔形态正常，无炎性细胞浸润或散在少量炎性细胞，轻微肺间质增生；模型组和假贴敷组大鼠支气管黏膜上皮细胞受损和脱落明显，气道壁不完整，黏膜下层炎性细胞浸润及水肿，支气管腔狭窄，肺泡内炎细胞浸润，肺泡间隔明显增厚；伏九贴敷组和地塞米松组大鼠支气管上皮较完整，支气管黏膜偶见炎性细胞浸润, 上皮细胞散在脱落，肺间质轻微增生。见图1。

图1 正常组和哮喘各组大鼠肺组织HE染色病理形态学表现

2.2各组大鼠肺组织病变半定量评分比较 模型组和假贴敷组大鼠肺组织炎性浸润评分、上皮细胞脱落评分、组织水肿评分及肺泡间隔增厚评分均明显高于正常组(P均<0.05)；伏九贴敷组和地塞米松组上述各项评分均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和哮喘各组大鼠肺组织病理评分比较[Q2(Q1,Q3)，分]

2.3各组大鼠血清IgE、TNF-α、IL-1β及Th17、Treg相关细胞因子水平比较 模型组和假贴敷组大鼠血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17水平均明显高于正常组(P均<0.05)，血清IL-10水平均明显低于正常组(P均<0.05)。伏九贴敷组和地塞米松组血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17水平均明显低于模型组(P均<0.05)，血清IL-10水平明显高于模型组(P均<0.05)，且血清IL-1β和IL-17水平与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和哮喘各组大鼠血清炎症因子及Th17、Treg相关细胞因子水平比较

2.4血清炎性因子及肺组织病理评分与血清IL-17、IL-10水平的相关性 肺组织炎性细胞浸润评分、上皮细胞脱落评分、组织水肿评分、肺泡间隔增厚评分及血清IgE、TNF-α、IL-1β水平与血清IL-17水平均呈显著正相关性(P均<0.05)，与血清IL-10水平则呈显著负相关性(P均<0.05)。见表3。

表3 血清炎性因子及肺组织病理评分与血清IL-17、IL-10水平间相关性分析

3 讨 论

穴位贴敷疗法是中医学特有的外治法之一。清代医家张璐发明的中药白芥子外涂治疗咳喘病的方法被后世医家视为穴位贴敷治疗支气管哮喘和支气管炎的经典方法而一直沿用至今，本院开展的冬病夏治伏九贴敷疗法也是在此基础上加减而来。本实验采用OVA联合Al(OH)3诱导大鼠哮喘模型，探讨了伏九贴敷药物对肺组织病理改变的影响。结果显示，造模后大鼠出现了支气管、细支气管上皮细胞坏死脱落，支气管周围炎性细胞浸润及水肿，支气管腔狭窄，肺间质增生，肺泡壁增厚等肺组织损伤改变，这与人类哮喘的肺部炎症病理特征相符；伏九贴敷药物干预后，无论是HE染色还是炎性细胞浸润、上皮细胞脱落、组织水肿、肺泡间隔增厚评分，都显示伏九贴敷药物可明显改善哮喘大鼠上述肺部炎症病理改变。

IgE是机体血浆中的一种免疫球蛋白，通常用于过敏性疾病患者的诊断。研究发现，哮喘患者具有血清IgE、C反应蛋白和嗜酸性粒细胞升高等特征[7]。当过敏原进入体内时，T细胞和B细胞分化为浆细胞，产生IgE抗体，特异性IgE抗体与其高亲和力受体FcεRI结合，激活肥大细胞。在FcεRI交联的几分钟内，肥大细胞脱颗粒，释放前列腺素、白三烯和组胺。数小时后，肥大细胞分泌IL-1β、TNF-α、MIP-1α、IL-13等细胞因子和各种趋化因子，这些细胞因子共同引起白细胞浸润和持续炎症[8-9]。本实验中OVA和Al(OH)3作为过敏原致敏激发大鼠哮喘，诱导其体内产生IgE抗体，引发免疫变态反应，血清IgE水平显著增加，大量促炎因子IL-1β、TNF-α释放，引起大鼠出现哮喘免疫炎症反应；穴位贴敷伏九贴后，IgE和IL-1β、TNF-α水平均显著降低，结合肺组织HE染色病理结果，提示伏九贴敷药物能有效改善哮喘大鼠炎性损伤，对哮喘炎性反应有明显的拮抗作用。

尽管人们对哮喘的认识不断提高，但其发病机制尚未完全明确。目前研究认为许多免疫细胞，特别是活化的T细胞可释放细胞因子，共同作用引起哮喘的发生[10]。其中Th2优势分化的Th1/Th2失衡是哮喘发病的一个重要免疫学机制的观点占据了主流，但由于哮喘发病机制的复杂性，Th2占优势的Th1/Th2失衡只是哮喘免疫机制的一部分，并不能完全解释哮喘的发病机制[11]。近年研究表明Th细胞是可塑的，新的Th细胞也能触发和扩大哮喘的炎症反应。Th17细胞属于截然不同的CD4+T细胞效应器家族，可分泌IL-17，IL-17能募集中性粒细胞，促进局部组织产生中性粒细胞相关趋化因子，从而加重局部炎症反应[12]。Treg细胞是一类控制免疫应答的T细胞亚群，其可通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子发挥免疫抑制作用，已经作为免疫抑制驱动器被广泛报道，在哮喘中也起着重要作用[13-16]。体内免疫稳态时，Th17和Treg相互制约，处于平衡状态，Th17/Treg细胞失衡会导致哮喘发生风险增高，因此研究Th17/Treg细胞失衡的分子机制成为当前热点[16-17]。相关实验研究发现，小鼠反复暴露于低剂量过敏原可促进调节性CD4+T细胞群的发育[18]，Treg细胞能抑制Th2和Th17细胞介导的炎症反应，防止哮喘动物模型气道炎症和支气管高反应的发生[19]。本实验结果显示，哮喘大鼠血清中Th17相关细胞因子IL-17水平明显升高，Treg相关细胞因子IL-10水平明显降低，出现Th17/Treg平衡向Th17漂移的现象；相关性分析显示，哮喘大鼠肺组织病理损伤各项指标及IgE、TNF-α、IL-1β水平与血清IL-17水平呈正相关，与血清IL-10水平呈负相关。提示Th17细胞增殖分化过多，作为促炎因子，过多的Th17细胞会正向诱导IgE、TNF-α、IL-1β水平升高，加重肺组织炎性损伤；Treg细胞免疫抑制功能减弱，不能有效抑制免疫应答，也导致IgE、TNF-α、IL-1β大量表达，造成哮喘大鼠肺部炎性损伤，提示Th17/Treg失衡介导哮喘炎症免疫应答。经伏九贴敷药物干预后，血清IL-10水平升高，血清IL-17水平降低，纠正了Th17/Treg漂移，减轻了Th17/Treg失衡介导的炎性反应，故IgE、TNF-α、IL-1β水平也随之降低，哮喘大鼠肺组织病理损伤亦随之减轻。

综上所述，伏九贴敷药物能有效减轻哮喘大鼠肺组织炎性损伤，减少IgE产生，降低外周血中炎性因子水平，对哮喘炎性变态反应有良好的拮抗作用，机制可能与其调节Th17/Treg失衡有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。