CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平与ACS患者GRACE评分的关系*

李 樱，黄 媛，陈 献，王亦文

1.武警特色医学中心军人全科医学科，天津 300162；2.武警后勤学院临床医学系，天津 300162； 3.武警特色医学中心急诊医学科，天津 300162；4.河北医科大学 第一医院心脏中心心功能科，河北石家庄 050000

急性冠状动脉综合征 (ACS) 是临床常见的以老年人群为主要发病群体的一种心血管疾病。ACS主要是由冠状动脉发生粥样硬化形成斑块且斑块不稳定导致的急性综合征，可分为不稳定型心绞痛(UAP)、急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)或非急性ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)，其中不稳定斑块纤维帽破裂、内膜浅表糜烂是ACS的主要病理基础[1-2]。目前已有研究证实，ACS的发生和病程进展与机体的免疫机制密切相关，其中CD4+T细胞作为机体免疫反应中重要成员，可通过表达多种炎性反应因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)参与早期动脉粥样硬化的形成过程，从而在ACS病程中发挥关键作用[3]。针对上述免疫因素和免疫炎症应答反应的治疗方案研究逐渐成为目前ACS的重要研究方向之一。近年来有研究报道T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白-3(TIM-3)作为表达于免疫细胞表面的一种重要抑制性分子，可以通过对T细胞功能发挥调控作用参与机体免疫耐受[4]。CD4+CD45RA+T细胞属于初始T细胞，经抗原刺激后转化为记忆T细胞即CD4+CD45RO+T细胞，记忆T细胞被刺激激活后可以迅速活化，并具备一系列细胞因子分泌功能以强化机体免疫功能。但目前关于TIM-3在CD4+T细胞中的表达情况以及其对ACS患者T细胞功能调控作用的报道罕见。本研究旨在探讨CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平在ACS发病过程中作用机制，从而为该病的诊断治疗提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2020年3月武警特色医学中心收治的212例ACS患者作为研究组，并以同期168例非冠心病检查者作为对照组。212例ACS患者中UAP、STEMI、NSTEMI患者分别有85例、69例、58例。根据全球急性冠状动脉事件注册(GRACE)评分结果对ACS组患者病情进行分级，分为低危组(GRACE<109 分，68例)、中危组(109≤GRACE≤140分，62例)以及高危组(GRACE>140分，82例)。所有研究对象均在知情同意书上签字，且本研究得到武警特色医学中心伦理委员会批准。

纳入标准：(1)研究组患者均经冠状动脉造影确诊为冠心病，且各分型符合ACS诊断标准[5]；对照组为因出现可疑心肌缺血症状入院检查，行冠状动脉造影后确定为冠状动脉狭窄程度<50%或冠状动脉正常的非冠心病患者。(2)年龄60～80岁者；(3)无认知功能障碍，具备基本读写能力者。

排除标准：(1)严重全身性炎症、严重肝、肾功能异常或精神疾病；(2)既往诊断患有风湿性心脏病、严重心力衰竭、急性心肌梗死或心脏瓣膜病变等疾病，以及左主干严重病变；(3)恶性肿瘤、自身免疫性疾病或血液系统疾病；(4)1年内行重大手术或外伤；(5)接受过冠状动脉支架植入术或冠状动脉旁路移植术；(6)近半年内服用细胞毒性药物、皮质醇类激素或升白细胞药物。

1.2方法

1.2.1一般资料收集 收集所有患者的一般临床资料，主要包括年龄、性别、血压(收缩压、舒张压)、身高、体质量、高血压史、糖尿病史以及相关实验室血清检查指标等。所有患者入院后30 min、药物开始治疗前抽取肘静脉血液标本，行血常规全项、心肌损伤标志物[心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]、肾功能、脑钠肽(Pro-BNP)以及血脂相关指标[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)]检测。

1.2.3冠状动脉造影 由两名及以上具有丰富冠状动脉造影临床经验的医师进行冠状动脉造影检查，检查过程中所有医生均严格按照手术流程进行操作。并安排两名经验丰富的且具有冠状动脉介入资格的副高级以上职称专家对每例研究对象冠状动脉造影结果进行评估，并界定左右冠状动脉及主要分支狭窄程度，认为冠状动脉直径狭窄程度<50%符合冠心病诊断[5]。

1.2.4GRACE评分 参考文献[6]，纳入年龄、收缩压、血肌酐、心率、Killip分级等8个临床指标并输入计算机系统中进行计算。GRACE评分为1～372分。根据GRACE评分结果，参考相关文献[6]报道的分组方法，对ACS组患者病情进行分级，分为低危组(GRACE<109 分，68例)、中危组(109分≤GRACE≤140分，62例)以及高危组(GRACE>140分，82例)。

1.2.5外周血中CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平测定 分别于对照组体检时以及研究组入院后抽取静脉血5 mL于肝素抗凝管中，并统一置于4 ℃冰箱中保存，将下层细胞分离后取100 μL采用流式细胞仪(厂家：赛默飞世尔；型号：Attune NxT)检测两组CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平。分别加入CD45-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP，美国BD公司)、CD45RA-异硫氰酸荧光素(FITC，美国贝克曼公司)以及抗CD4FITC(美国BD公司)和抗TIM-3-PE(美国BD公司)进行免疫荧光抗体标记。将所有样品放置于4 ℃条件下孵育30 min，进行充分洗涤后加入适量多聚甲醛(浓度为4%)PBS溶液进行固定，然后对CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平进行检测。

2 结 果

2.1对照组、研究组一般资料的比较 两组研究对象年龄、性别、体质量指数、糖尿病、高血压、收缩压和心率等一般基线资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2两组患者生化指标水平及CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平比较 研究组ACS患者生化检查指标TC、TG、LDL、cTnI、Pro-BNP、CK-MB以及CD4+CD45RA+T细胞、CD4+TIM-3+T细胞水平均高于对照组，HDL水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者生化指标水平及CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平比较

组别ncTnI(μg/dL)Pro-BNP(μg/dL)CK-MB(μg/mL)CD4+TIM-3+T细胞水平CD4+CD45RA+T细胞水平研究组21211.52±3.20174.62±11.2551.02±3.240.196±0.0380.166±0.042对照组1680.07±0.0285.46±10.472.98±1.630.158±0.0400.102±0.035t52.09879.102187.9499.4028.605P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.33组ACS患者生化指标及CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平比较 高、中、低危组ACS患者间生化指标和CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组ACS患者生化指标及CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平比较

组别ncTnIPro-BNP(μg/dL)CK-MB(μg/mL)CD4+TIM-3+T细胞水平CD4+CD45RA+T细胞水平高危组8213.41±3.69ab194.42±12.26ab69.47±5.32ab0.168±0.041ab0.188±0.041ab中危组6210.07±3.23a87.48±10.58a43.98±4.23a0.136±0.039a0.148±0.039a低危组686.10±2.1256.17±8.6234.21±4.100.122±0.0350.115±0.032F100.4493470.5901162.65027.69010.848P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.4ACS患者CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平与GRACE评分相关性分析 Pearson相关分析显示，ACS患者的CD4+TIM-3+T细胞水平、CD4+CD45RA+T细胞水平均与GRACE评分呈正相关(r=0.644、0.518，P<0.05)。

2.5CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平诊断高危ACS患者ROC曲线分析 ROC曲线分析显示，CD4+TIM-3+T细胞诊断高危ACS患者最佳截断值为0.129，曲线下面积为0.856(95%CI：0.790～0.910)，灵敏度、特异度分别为79.27%、78.46%。CD4+CD45RA+T诊断高危ACS患者最佳截断值为0.165，曲线下面积分别为0.837(95%CI：0.874～0.901)，灵敏度、特异度分别为75.61%、80.77%，见表4。

表4 CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平对高危ACS患者诊断价值

2.6不同CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平患者院内心脏不良事件发生率比较 分别以CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平最佳截断值为界值，低CD4+TIM-3+T细胞组[18.46%(12/65)]院内心脏不良事件(新发心力衰竭、心律失常、心源性休克、再梗死和全因死亡)的发生率明显低于高CD4+TIM-3+T细胞组[44.22%(65/147)]，差异有统计学意义(χ2=12.927，P<0.05)；低CD4+CD45RA+T细胞组院内心脏不良事件发生率[24.19%(15/62)]患者明显低于高CD4+CD45RA+T细胞组[41.33%(62/150)]，差异有统计学意义(χ2=5.572，P<0.05)。

3 讨 论

GRACE评分是目前临床首选的一种ACS患者入院时评分系统，也是目前针对ACS患者进行风险管理和评估预后情况的有效指标之一[7]。GRACE评分以8个预后变量为基础建立一种预测性逻辑模型，从而在GRACE风险计算器中计算以得出预后评分，以评估ACS患者治疗期间以及出院后的心血管意外发生风险[8]。目前已有研究证实ACS患者的冠状动脉病变严重程度、左心功能不全、院内外心脏不良事件发生率均与GRACE评分存在显著相关性，是评估ACS长、短期预后的一种可靠评分工具[9]。

多种免疫机制及免疫细胞如T淋巴细胞、巨噬细胞以及单核细胞均参与冠心病和ACS发生及发展过程。CD4+T细胞也称辅助/诱导性T细胞(Th)，包括调节性T细胞、Th1、Th2、Th17等亚型。CD4+T细胞具有合成和产生细胞因子功能，能够协助B细胞分泌抗体并发挥调节其他T细胞免疫应答功能，在维持免疫平衡中发挥关键作用[10]。动脉粥样硬化斑块中主要以CD4+T细胞为主，其对动脉粥样硬化抗原进行特异性识别后，会启动一系列免疫反应并促进白细胞介素(IL)-2、TNF-α、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)等促炎因子分泌以及免疫细胞在血管中的黏附，从而进一步加重血管炎性反应和动脉粥样硬化斑块形成与进展[11]。CD4+CD45RA+T细胞在体内经抗原刺激后转化为记忆T细胞即CD4+CD45RO+T细胞，记忆T细胞被刺激激活后可以发生迅速活化，然后具备一系列细胞因子分泌功能以强化机体免疫功能。但在人体外周血中大部分Treg表型属于CD45RA-，仅可检测一部分初始T细胞的表型属于CD45RA+[12-13]。本研究结果显示，研究组生化检查指标以及CD4+CD45RA+T细胞水平高于对照组，HDL水平低于对照组(P<0.05)。提示ACS患者的CD4+CD45RA+T细胞经抗原刺激后转化为记忆T细胞数量一定程度上减少，ACS患者的免疫机制受到一定程度的抑制。说明机体免疫系统和T细胞参与ACS发生、发展，但其具体机制仍有待进一步研究。马岳等[14]研究结果显示，UAP、STEMI、NSTEM与非冠心病者相比，外周血中CD4+CD45RA+T细胞比例明显升高，且CD4+CD45RO+T细胞比例明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；但3组患者间相比，CD4+CD45RA+T细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。分析可能原因如下，CD4+CD45RA+T细胞分化具有一定可逆性，其发生分化后可能会再次表达CD45RA抗原。且ACS患者3组亚组虽然表现类型不同，但均属于冠状动脉粥样硬化病理改变，因此CD4+CD45RA+T细胞比例变化差异不显著[15]。

TIM-3是新近发现的一种新型免疫调节分子，其在分化中末期Th细胞上具有表达选择性，且具有介导免疫耐受反应作用。研究报道抑制TIM-3表达已经成为部分实体瘤进行针对性免疫治疗的重要研究方向，且已经取得一定成效[16]。TIM-3可以通过抑制CD4+T、CD8+T细胞的活性，从而减少相关炎症因子的分泌。已有前期研究证实冠心病患者T细胞以及自然杀伤T细胞表面的TIM-3表达水平高于健康人群[17]。禹海文等[18]研究报道TIM-3还可以通过抑制血管内皮细胞中LDL表达从而诱导和促进动脉粥样硬化斑块形成，加重冠状动脉粥样硬化及ACS患者病情进展，且研究发现慢性心衰患者 CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞中TIM-3阳性细胞比例均呈高表达。本研究结果显示，研究组CD4+TIM-3+T细胞水平高于对照组(P<0.05)，与禹海文等[18]研究结果相似，提示CD4+TIM-3+T细胞水平在ACS等心血管病变疾病中发挥重要作用。ACS和心力衰竭患者外周血中CD4+TIM-3+T细胞水平高表达提示机体出现了T细胞功能紊乱。本研究进一步证实高、中、低危组3组ACS患者间生化指标和CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平差异均有统计学意义(P<0.05)。提示不同病情严重程度ACS患者的T细胞功能紊乱程度不一致。相关分析显示，ACS患者CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平分别与GRACE评分呈正相关，对于评估ACS患者疾病严重程度及预后评估方面具有一定临床价值。ROC曲线分析发现，CD4+TIM-3+T细胞、CD4+CD45RA+T细胞水平诊断高危ACS患者均具有较高诊断价值。低CD4+TIM-3+T细胞组[18.46%(12/65)]院内心脏不良事件的发生率明显低于高CD4+TIM-3+T细胞组[44.22%(65/147)]，差异有统计学意义(P<0.05)；低CD4+CD45RA+T细胞组院内心脏不良事件发生率[24.19%(15/62)]明显低于高CD4+CD45RA+T细胞组[41.33%(62/150)]，差异有统计学意义(P<0.05)，进一步证实CD4+TIM-3+T细胞和CD4+CD45RA+T细胞水平对于ACS患者病情严重程度和预后的评估具有一定价值，且具有简便和可操作性强等优势。

综上所述，ACS患者CD4+CD45RA+T 细胞、CD4+TIM-3+T细胞水平均显著高于健康人群，且二者均与ACS患者GRACE评分呈正相关，并对预测高危ACS和患者预后情况具有较高诊断价值。