GABRA3突变通过抑制TGF-β1/SMAD2信号通路调控神经元的凋亡、突触形成和递质释放

付伦姣，罗成宏，杨媚，陆伟恒，廖成钜

(东莞市松山湖中心医院 神经内科，广东 东莞 523326)

甲亢性低钾周期性麻痹(thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis,THPP)是以突发、复发及可逆发作的肌肉无力为特征的一种甲亢疾病，占甲亢患者的3%～6.8%[1]。统计发现亚洲THPP的发病率较高，男性为最主要发病人群。然而到目前为止THPP的发病机制仍不明确[2]。钙通道α3亚基基因(calcium channel α3 subunit gene,GABRA3)为氯通道蛋白家族成员，编码GABA受体α3亚单位。该基因高度表达于神经细胞和神经肌肉接头处[3]，此前研究发现GABRA3 参与调控肿瘤的转移[4-5]、动物的行为及情绪反应[6]，并被发现与先兆子痫、癫痫、脑病及畸形特征相关[3,7]。值得注意的是一项基于泰国人群的全基因组关联性分析发现，GABRA3基因2个单核苷酸多态性(SNP)位点(rs12688628 与rs750841)基因多态性与THPP有关[8]。肌无力是THHP 的重要症状。有研究表明GABRA3表达于脑部和骨骼肌的多个位点[6,9-10]，有可能参与调节THHP的肌无力症状，其基因位点突变有可能影响神经肌肉接头处递质的传递[11]，从而导致乏力的发生。提示GABRA3基因突变可能与 THPP 的发病有关，然而GABRA3基因突变对神经元生长、凋亡、突触形成、递质释放等的作用及其机制并不清楚。

因此，本研究探讨GABRA3突变对神经元细胞突触形成、凋亡水平及神经递质乙酰胆碱释放的影响，初步获得GABRA3突变对神经元细胞突触形成、凋亡水平及神经递质乙酰胆碱释放的影响的潜在机制，为GABRA3突变的临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人脑皮层神经元细胞(CP-H120)购于武汉普诺赛生物科技有限公司；胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)和杜氏改良培养液(DMEM)/F12培养基购于美国Gibco公司；四唑化合物(MTS)试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司；转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1/信号转导蛋白Sma-Mad族2(Sma-Mad2,SMAD2)信号通路的激活剂SRI-011381购于美国MedChemExpress公司；蛋白质提取试剂盒购于德国Novagen公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)购于美国默克Sigma-Aldrich公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)、Bax、TGF-β1、SMAD2、磷酸化的SMAD2(P-SMAD2)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和突触蛋白I(Synapsin I)第一抗体以及IgG-HRP偶连的抗体第二抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司。电化学发光(ECL)检测试剂购于美国GE Healthcare Bio-Sciences公司。DeadEndTM比色末端脱氧核苷酸转移酶末端标记(TUNEL)系统(G7130)购于美国Promega公司。Alexa Fluor 594偶联的二抗和二脒基苯基吲哚(diamino-2-phenyl indole,DAPI)均购于美国Thermo Fisher Scientific公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购于德国BD Biosciences公司。酶联免疫吸附测定(ELISA)测定试剂盒购于美国Invitrogen eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 人脑皮层神经元培养 将CP-H120人脑皮层神经元细胞置于6孔板2 ml DMEM/F12培养基，培养基中添加10%FBS，培养条件为含5%的CO2及37 ℃的培养箱，收集细胞对数生长期的细胞(1×106ml-1)进行后续处理。

1.2.2 GABRA3突变型和野生型人脑皮层神经元构建以及细胞的给药和分组 本实验对CP-H120人脑皮层神经元进行基因突变型的构建，合成野生型GABRA3(wt-GABRA3组)、突变型GABRA3(mut-GABRA3组)、质粒(General Biosystems,Inc)。其次，为研究突变对人脑皮层神经元的影响，在转染前将细胞以5×105ml-1的密度接种到6孔板中并培养24 h。根据制造商的说明，使用lipofectin3000将wt-GABRA3、mut-GABRA3、质粒转染到含细胞的孔中转染48 h。

1.2.3 四唑化合物(MTS)测定法检测细胞增殖 wt-GABRA3组和mut-GABRA3组细胞分别接种在96 孔板中(2.0×104孔-1)，培养48 h后通过MTS测定法测定细胞增殖。将MTS溶液(20 μl)添加到板子的每个孔中，然后将培养板在37 ℃下孵育 1 h，并读取450 nm处 的吸光度值。

1.2.4 TUNEL检测神经元细胞凋亡 神经元细胞的凋亡水平检测采用 TUNEL法。wt-GABRA3组和mut-GABRA3组细胞制作切片后，根据制造商的说明使用DeadEndTM 比色 TUNEL系统。用DAPI对细胞核进行复染，利用Image-Pro Plus 软件检测每个细胞切片的变化，凋亡细胞确定为每组5个不同视野区域的测量值。在此条件下，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈荧光绿，凋亡指数通过凋亡细胞数与细胞总数比值计算。

1.2.5 流式细胞术分析神经元细胞凋亡 wt-GABRA3组和mut-GABRA3组细胞分别接种在96 孔板中(2.0×104孔-1)并培养24 h，根据制造商的说明使用 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。细胞在冰上用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶联的Annexin V 和碘化丙啶(5 mg·ml-1)染色30 min，然后通过流式细胞术(BD Biosciences)进行检测，使用FlowJo 9.1软件分析数据。

1.2.6 蛋白质印迹法 使用蛋白质提取试剂盒获取wt-GABRA3组和mut-GABRA3组的细胞总蛋白。通过Bensadoun等[12]的方法对蛋白质进行定量，细胞蛋白通过10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与caspase3(1∶500)、Bax(1∶500)、TGF-β1(1∶400)、SMAD2(1∶800)、P-SMAD2(1∶600)、GAPDH(1∶2 000)一抗和辣根过氧化物酶偶联的二抗连续孵育后使用ECL检测试剂观察免疫印迹，对检测到的条带进行定量。

1.2.7 细胞免疫荧光 wt-GABRA3组和mut-GABRA3组细胞被4%聚四氟乙烯固定10 min,并使用0.1% Triton x-100在PBS中通透 10 min。室温下切片用10%的正常山羊血清封闭1 h，进一步于4 ℃用Synapsin I一抗孵育过夜。细胞与Alexa Fluor 594偶联的二抗孵育1 h。载玻片最后经过DAPI染色后封装于抗荧光淬灭试剂中,使用奥林巴斯荧光显微镜采集荧光图像。

1.2.8 神经元细胞突触数的测量 以目的神经元胞体中心为圆心，两倍胞体长度为半径作圆，计算圆内 Synapsin I 染色阳性的数目，表示单个细胞形成的突触数目。

1.2.9 乙酰胆碱的ELISA检测 根据乙酰胆碱ELISA测定试剂盒提供的说明检测wt-GABRA3组和mut-GABRA3组细胞培养上清液中乙酰胆碱的水平，在酶标仪中于450 nm处读取吸光度值。

1.3 统计学处理

所有结果使用3次以上独立实验的均数±标准差表示，两组数据采用t检验进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 GABRA3突变对人脑皮层神经元细胞增殖的影响

为验证该推测，本实验构建慢病毒介导的GABRA3突变型和野生型质粒，将wt-GABRA3和mut-GABRA3慢病毒质粒导入细胞内，并检测GABRA3突变对细胞增殖率的影响。mut-GABRA3组细胞的相对细胞增殖率为(59.19±2.12)%,明显低于wt-GABRA3组的(92.32±4.22)%，差异有统计学意义(t=16.334，P=0.009)。

2.2 GABRA3突变对人脑皮层神经元细胞凋亡的影响

利用TUNEL法检测神经元细胞的凋亡变化发现，mut-GABRA3组细胞的凋亡强度明显高于wt-GABRA3组，见图1A。我们继续使用流式细胞术检测GABRA3突变对细胞凋亡率的影响，mut-GABRA3组细胞的相对细胞凋亡率为(35.12±4.55)%,明显高于wt-GABRA3组的(4.21±0.43)%，差异有统计学意义(t=17.211，P=0.004),见图1B。

A.TUNEL法检测人脑皮层神经元的凋亡(× 400)，标尺=50 μm；B.流式细胞术检测凋亡细胞的比例图1 GABRA3突变对人脑皮层神经元凋亡的影响A.TUNEL assay was used to detect the apoptosis of neurons in human cortex(×400),with a scale of 50 μm;B.The proportion of apoptotic cells was measured by flow cytometryFig 1 Effects of GABRA3 mutation on apoptosis of human cortical neurons

使用蛋白质印迹法检测发现，mut-GABRA3组细胞中caspase3和Bax的相对水平(4.25±0.43、5.03±0.52)明显高于wt-GABRA3组(1.00±0.04、1.00±0.02)，差异均有统计学意义(t值分别为19.112、19.822；P值分别为0.002、0.001)(图2)。

与wt-GABRA3组比，*P<0.05图2 GABRA3突变对人脑皮层神经元凋亡标志物的影响*P<0.05 vs. wt-GABRA3Fig 2 Effects of GABRA3 mutation on apoptotic markers of human cortical neurons

2.3 GABRA3突变对人脑皮层神经元细胞突触形成的影响

利用免疫荧光法检测神经元细胞的突触形成蛋白Synapsin I发现，mut-GABRA3组细胞轴突的相对荧光强度(0.37±0.05)明显低于wt-GABRA3组(0.57±0.04)，差异有统计学意义(t=16.223，P=0.005)(图3)。mut-GABRA3组细胞突触密度为(13.33±1.12)%，明显低于wt-GABRA3组的(78.23±2.15)%，差异有统计学意义(t=23.234，P=0.001)(图3)。

细胞免疫荧光法观察mut-GABRA3组中 Synapsin I的表达变化图3 GABRA3突变对神经元细胞突触密度及突触蛋白表达的影响(×400)The expression of Synapsin I in mut-GABRA3 group was observed by cellular immunofluorescence methodFig 3 Effects of GABRA3 mutation on synaptic density and synaptic protein expression in neurons(×400)

2.4 GABRA3突变对人脑皮层神经元递质释放的影响

进一步使用ELISA法研究GABRA3突变对神经元乙酰胆碱释放的影响，mut-GABRA3组的乙酰胆碱相对水平(0.56±0.07)明显低于wt-GABRA3组(1.00±0.03)，差异有统计学意义(t=17.289，P=0.002),见图4。

与wt-GABRA3组比，*P<0.05图4 GABRA3突变调节乙酰胆碱*P<0.05 vs. wt-GABRA3Fig 4 GABRA3 mutations regulate acetylcholine

2.5 GABRA3突变通过抑制TGF- β1/SMAD2信号通路调控神经元的凋亡、突触形成和递质释放

经过蛋白质印迹法检测，我们发现mut-GABRA3组的TGF-β1和p-SMAD2蛋白明显低于wt-GABRA3组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图5。

我们在mut-GABRA3组细胞中加入TGF-β1/SMAD2激活剂SRI-011381，结果显示神经元的凋亡率明显下调(图6A、B)，caspase3和Bax水平明显降低(图6C)，而且突触密度明显增加(图6D)，神经递质乙酰胆碱的水平(0.89±0.12)明显高于mut-GABRA3组(0.56±0.07)，差异有统计学意义(t=14.677，P=0.006)。

与wt-GABRA3组比，*P<0.05图5 GABRA3突变对人脑皮层神经元TGF-β1/SMAD2信号通路蛋白表达的影响*P<0.05 vs.wt-GABRA3Fig 5 Effects of GABRA3 mutation on protein expression of TGF-β1/SMAD2 signaling pathway in human cortical neurons

3 讨 论

THPP疾病基因的遗传变异与THPP相关的功能意义仍不清楚。目前，人们已经观察到遗传易感性在THPP中起作用，与THPP相关的SNP研究主要集中在CACNA1S、SCN4A、KCNE3 3个通道基因，分别为编码骨骼肌Ca2+通道、Na+通道和K+通道的基因[13]。有研究[8]发现，GABRA3的3号内含子的SNPs与THPP密切相关。

前期本实验室研究发现，中国南方汉族人群THPP患者(n=35)的GABRA3基因3号内含子rs12688628位点G等位基因型在THPP 组的突变频率升高，而且rs12688628位点G/T多态性与THPP 发病具有显著相关性，表明GABRA3基因可能为THPP的易感基因之一。因此，本研究进一步探讨了GABRA3对神经元凋亡和突触形成的调节作用和机制，我们的研究结果表明，GABRA3突变可以调节神经元的凋亡和突触形成。GABRA3是γ-氨基丁酸A型受体的一个亚基，多个此类亚基组成氯离子通道[14]。目前已在多种肿瘤研究中证实GABRA3蛋白过表达能促进细胞增殖，GABRA3在肿瘤中易受到微小RNA的调节，从而改变其表达，并促进三阴性乳腺癌[15]和胰腺癌[16]细胞的增殖。目前尽管缺乏GABRA3对神经元细胞增殖影响的研究，但也有研究表明，配体GABA可以刺激正常神经元细胞增殖[17]。本研究构建慢病毒介导的神经元GABRA3野生及突变细胞株，发现相比于wt-GABRA3组神经元，mut-GABRA3的神经元细胞增殖能力减弱，并且突触密度急剧下降。目前仍缺乏关于GABRA3突变调控神经元细胞增殖和突触密度降低机制的解释。

续图

与mut-GABRA3组比，*P<0.05A.TUNEL法检测人脑皮层神经元的凋亡(×400)，标尺=50 μm；B.流式细胞术检测凋亡细胞的比例；C.蛋白质印迹法检测人脑皮层神经元中caspase3和Bax的表达水平；D.突触形成密度的统计图图6 GABRA3突变通过抑制TGF-β1/SMAD2信号通路调控神经元的凋亡、突触形成和递质释放*P<0.05 vs.mut-GABRA3A.TUNEL assay was used to detect the apoptosis of human cortical neurons(×400),with a scale of 50 μm;B.The proportion of apoptotic cells was measured by flow cytometry;C.The expression levels of caspase3 and Bax in human cortical neurons were detected by Western blot;D.Statistical graph of synaptic formation densityFig 6 GABRA3 mutation regulates neuronal apoptosis,synaptic formation and transmitter release by inhibiting TGF-β1/Smad2 signaling pathway

神经类固醇是神经系统响应细胞应激所产生的内源性调节剂，是神经递质系统[18]的有效调节剂。其中GABA(A)受体(GABA-A receptor,GABRs)的强增强剂四氢孕酮就被多项研究证明可保护视网膜使其损伤减轻[19-21]。而当使用特定的GABR拮抗剂后四氢孕酮的神经保护作用被抑制，说明GABR信号可介导神经的保护。神经元凋亡是神经突触损伤的一个关键特征[22]。在本研究中我们通过TUNEL实验和流式细胞术均观察到神经元中突变的GABRA3可以明显增加神经元的凋亡，而且增加细胞中Caspase3和Bax的表达，另外神经递质乙酰胆碱的水平明显降低，这表明GABRA3突变可能通过促进细胞凋亡并抑制神经递质释放从而抑制神经元突触的生长。

TGF-β1广泛表达于中枢神经系统[23]。已有研究显示TGF-β1/SMAD2信号通路对调节神经元细胞的存活具有重要作用，且对神经递质乙酰胆碱的活性具有增强作用，而且TGF-β1分子也是突触形成所必需的关键分子，能调节神经肌肉接头的功能[24]。因此我们推测，TGF-β1通路有可能参与维持细胞外基质结构稳定性、调节突触形成和神经元细胞活性以及乙酰胆碱的释放。另外已有研究[4]证实，通过GABRA3激活Akt通路从而促进乳腺癌细胞的增殖，而且Akt也是TGF-β1的一个关键下游途径，因此我们深入研究了GABRA3突变神经元中TGF-β1/SMAD2信号途径的作用，结果证实TGF-β1/SMAD2 信号通路被突变的GABRA3所抑制，而当我们使用TGF-β1/SMAD2信号激活剂SRI-011381时，神经元细胞的凋亡率明显降低，乙酰胆碱的释放以及突触密度也有显著的增加。以上结果均表明，GABRA3突变通过抑制TGF-β1/SMAD2信号通路促进神经元的凋亡，并抑制突触形成和递质释放。

综上所述，基于以上实验结果及分析，我们提出GABRA3基因多态性与THHP 的发病有关；GABRA3 基因突变会显著影响GABRA3在神经元细胞中的生物学功能，其中主要是调节神经元细胞的突触形成。同时还证实了GABRA3突变抑制TGF-β1/SMAD2通路，从而促进神经元凋亡并抑制神经元细胞突触形成。