PD-1、PD-L1蛋白在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义*

秦绪颖，刘秀芳，张丽丽，隋红梅，李爱华

252000 山东 聊城，山东第一医科大学附属聊城医院 妇产科(秦绪颖、张丽丽、隋红梅、李爱华); 252000 山东 聊城，聊城市东昌府区妇幼保健院 产科(刘秀芳)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1],高级别和转移/复发性EC患者预后差且存活率低，目前尚无明确推荐的靶向药物。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是肿瘤细胞和宿主免疫系统相互作用的主要位点[2],是目前肿瘤学家关注的热点。PD-1表达于多种免疫细胞表面[3]，是免疫检查点,可抑制过度免疫反应，防止自身免疫[4]。PD-L1作为PD-1的特异性配体，发挥分子“屏蔽”作用，使PD-L1表达阳性的肿瘤细胞免受CD8阳性T细胞介导的免疫杀伤作用[5]。PD-1/PD-L1通路是TME影响肿瘤发生发展的关键机制之一。

阻断PD-1/PD-L1通路能够在具有高度免疫原性的肿瘤中表现出持久的肿瘤抑制作用，并带来长期缓解[6]。一项对宫颈鳞状细胞癌的研究显示，PD-L1阳性患者对pembrolizumab(帕博利珠单抗)显示出良好的反应性[7]。而nivolumab(纳武利优单抗)在铂类耐药卵巢癌患者中也显示出令人鼓舞的疗效[8]。EC被认为是一种具有高度免疫原性的疾病[9]，已有学者对其开展了关于PD-1/PD-L1通路的临床试验[10]，但相关研究仍然较少。本课题通过检测EC组织中PD-1、PD-L1表达情况，探讨其作为EC组织中TME机制与生存期的关系,以期为EC的免疫治疗提供更多依据。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

兔抗人PD-L1单克隆抗体(SP142)、免疫组化抗原修复缓冲液(pH 8.0/9.0)：北京中杉金桥生物技术有限公司；鼠抗兔PD-1抗体(MX033)；即用型免疫组化EliVixion plus试剂盒(鼠/兔)(Kit-9901)、DAB显色试剂盒(20×)(DAB-0031)：福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 研究对象

收集本院病理科2007年1月至2009年1月的子宫内膜组织石蜡标本，其中正常子宫内膜标本20例，EC标本112例,患者年龄36～79岁，中位58.5岁；未绝经者63例，已绝经者49例；Ⅰ型(子宫内膜样癌)标本102例，Ⅱ型EC标本10例(透明细胞EC2例,浆液性EC8例)；高、中分化EC 62例，低分化EC 50例；分期参照2009年FIGO标准：早期(Ⅰ～Ⅱ期)80例,晚期(Ⅲ～Ⅳ期)32例；淋巴结阳性79例，淋巴结阴性33例，浅肌层浸润49例，深肌层浸润63例。所有标本均由2位经验丰富的病理科专家阅片，所有患者术前均未进行过任何辅助治疗，具有完整的病历资料，随访从手术日起到随访日期或死亡日期，10例失访。所有患者家属知情并签署知情同意书，本研究由本院伦理委员会审查并批准。

1.3 实验方法

采用免疫组化SP法检测PD-1、PD-L1蛋白表达。评分标准及结果判定：该实验选用双盲法，由两位病理科专业医师单独阅片并进行评分(本研究中以PD-1、PD-L1在淋巴细胞中的染色为阳性表达)，镜下随机观察5个高倍镜视野，每视野计数100个淋巴细胞，观察淋巴细胞的染色强度及数目，评估样品PD-L1和PD-1阳性淋巴细胞的染色强度和所占百分比，无染色为0分，淡黄色为1分，黄色至褐色为2分，深褐色3分，超过5%淋巴细胞染色强度≥2认定为阳性。

1.4 统计学分析

使用SPSS 25.0统计软件处理数据，卡方检验(Pearson、Fisher精确检验)用于分析PD-1、PD-L1组间表达差异及其与临床病理特征的相关性，采用Spearman分析EC组织中PD-1与PD-L1表达的相关性；通过Kaplan-Meier法进行生存分析，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 PD-1、PD-L1在正常子宫内膜及EC组织中的表达情况

2.1.1 PD-1在正常子宫内膜及EC组织中的表达 正常子宫内膜组织中PD-1阳性表达率为25.0%，主要定位于淋巴细胞细胞膜和细胞质中，显示为散在的淡棕黄色颗粒；EC组织中PD-1阳性表达率为61.6%，定位于肿瘤间质淋巴细胞的细胞膜和细胞质，弥漫或散在分布,表现为黄色、棕色、棕褐色颗粒。EC组织中PD-1阳性表达率明显高于正常子宫内膜(表1，图1)。

表1 正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中PD-1的表达情况

图1 PD-1在正常子宫内膜及子宫内膜样腺癌中的表达

2.1.2 PD-L1在正常子宫内膜及EC组织中的表达 PD-L1在正常子宫内膜组织中阳性表达率为30.0%，主要定位于淋巴细胞的细胞质或细胞膜,为散在的棕黄色颗粒,或弥漫的黄色物质。在EC组织中PD-L1蛋白主要定位于肿瘤间质淋巴细胞的细胞质和细胞膜上，表现为散在或弥漫的棕黄色、黄色颗粒，少数定位于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜上，PD-L1在EC组织中的阳性表达率为64.7%，明显高于正常子宫内膜(表2，图2)。

表2 正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中PD-L1的表达情况

图2 PD-L1在正常子宫内膜及子宫内膜样腺癌中的表达

2.2 EC组织中 PD-1、PD-L1的表达与不同临床病理参数的关系

2.2.1 EC组织中 PD-1的表达与临床病理参数的关系 EC组织中PD-1阳性表达率，高中分化组高于低分化组(75.8%vs50.0%,χ2=7.911，P=0.005)，早期高于晚期(78.8%vs53.1%；χ2=5.168，P=0.023)，淋巴结阴性组高于阳性组(79.7%vs48.5%；χ2=5.839，P=0.016)，浅肌层浸润组高于深肌层组(77.6%vs46.0%；χ2=5.873,P=0.015)，均呈负相关，差异均有统计学意义；PD-1表达与年龄、绝经状态、EC类型无关(表3)。

表3 患者临床病理特征与子宫内膜癌组织中PD-1的表达情况

2.2.2 EC组织中PD-L1的表达与临床病理参数的关系 EC组织中PD-L1阳性表达率，低分化组高于高中分化组(78.0%vs53.2%；χ2=7.399，P=0.007)，晚期高于早期(87.5%vs55.0%；χ2=9.148，P=0.002)，淋巴结阳性组高于阴性组(87.9%vs54.4%；χ2=9.933，P=0.002)，深肌层浸润组高于浅肌层组，均呈正相关,差异均有统计学意义(74.6%vs51.0%；χ2=6.677，P=0.010)。除此之外，PD-L1阳性表达率与患者年龄、绝经状态无关(表4)。

表4 患者临床病理特征与子宫内膜癌组织中PD-L1的表达情况

2.3 EC组织中 PD-L1和PD-1 蛋白表达的相关性

在EC组织，PD-1的阳性表达率为61.6%，PD-L1的阳性表达率为64.7%，Spearman相关性分析检验显示：rs=0.025，P=0.797，二者表达没有相关性(表5)。

表5 PD-1表达与PLD-L1表达的相关性

2.4 EC组织中PD-1和PD-L1蛋白表达与患者术后总生存期的关系

采用 Kaplan-Meiri法分析 PD-1及PD-L1表达与总生存期(overall survival,OS)的关系，PD-1阳性组优于阴性组[(95.8±3.8)个月vs(79.6±5.0)个月；χ2=6.551,P=0.010]；PD-L1阴性组优于阳性组[(111.5±3.3)个月vs(77.25±3.7)个月；χ2=27.020，P<0.001]。另外，单因素分析显示OS与病理类型、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润深度、PD-1、PD-L1表达有关，多因素分析表明病理类型、FIGO分期、PD-1、PD-L1蛋白表达是独立预后因素(表6，图3、4)。

表6 Kaplan-Meier生存分析

图3 EC组织中PD-1蛋白表达与生存关系图

图4 EC组织中PD-L1蛋白的表达与生存关系图

根据PD-1、PD-L1蛋白在EC中的表达将其分为4种类型，I型：PD-1阳性+PD-L1阳性；II型：PD-1阳性+PD-L1阴性；III型：PD-1阴性+PD-L1阳性；IV型：PD-1阴性+PD-L1阴性。采用Kaplan-Meiri对4个组合进行生存分析，结果表明：II型患者OS最长，III型OS最差(χ2=43.915,P<0.001)，各组数据两两比较统计学意义如下：IvsII(P=0.018)；IvsIII(P=0.038)；IvsIV(P=0.256)；IIvsIII(P<0.001)；IIvsIV(P=1.000)；IIIvsIV(P<0.001)(图5、6)。

图5 依据PD-1、PD-L1表达的子宫内膜癌四分型(40×)

图6 EC组织中PD-1、PD-L1蛋白组合表达与生存关系图

3 讨 论

3.1 PD-1、PD-L1在不同肿瘤组织中表达及与临床病理特征的关系

PD-1及PD-L1在许多类型恶性肿瘤中表达上调，与临床病理参数存在密切联系。Chiu等[11]研究发现PD-1和PD-L1在胃癌组织中均表达升高，其中PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)特别是CD3阳性效应T细胞表达升高；而PD-L1表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及组织学分级显著相关[12-15]。在乳腺癌中的研究结果与此相似，且PD-1和PD-L1表达也存在较强的相关性[14]，因此作者认为表达于肿瘤细胞的PD-L1与TIL细胞表面PD-1相互作用，从而抑制免疫系统启动对癌细胞的杀伤作用[14,16]。

本研究结果显示，EC组织中PD-1主要分布于肿瘤间质淋巴细胞的细胞膜和细胞质中，阳性表达率为61.6%，显著高于正常子宫 内膜，表达与组织分化、FIGO分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度呈负相关。而PD-L1蛋白主要分布于肿瘤间质淋巴细胞的细胞质和细胞膜上，少数分布于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜(本研究将淋巴细胞PD-L1表达阳性定义为组织表达阳性)。但在2例子宫内膜透明细胞癌组织中PD-L1主要定位于肿瘤细胞。PD-L1阳性表达率为64.7%，显著高于正常子宫内膜，表达与病理类型、组织学分级、FIGO分期、淋巴结转移、浸润深度呈正相关，与患者年龄、绝经状态无关。EC组织和正常子宫内膜中PD-1和PD-L1蛋白的表达差异及二者与临床病理特征之间的相关性进一步证明了PD-1/PD-L1蛋白可能成为预测EC不良结局的独立因素。然而，在本研究中EC组织的PD-1与PD-L1蛋白表达并没有显示出相关性。

3.2 PD-1、PD-L1表达的预后价值

多项研究表明PD-L1表达与癌症患者的预后密切相关，如黑色素瘤[17]、肾癌[18]、肺癌[19]和结肠直肠癌[20]，PD-L1过表达的患者预后较差,其原因可能在于PD-L1表达可导致TIL功能受损，阻碍抗肿瘤免疫[14]。本研究结果显示，在EC组织中PD-1阳性组OS优于阴性组，PD-L1阴性组OS优于阳性组，单因素分析显示OS与PD-1、PD-L1表达、病理类型、FIGO分期、淋巴结转移、浸润深度有关，多因素分析表明病理类型、FIGO分期、PD-1、PD-L1蛋白表达是EC的独立预后因素，结果证实了EC组织中PD-L1表达对预后的不良影响，以及PD-1高表达的生存获益[15]。基于PD-1与PD-L1在EC中的表达情况，将其分为四种类型，Ⅰ型：PD-1阳性+PD-L1阳性；Ⅱ型：PD-1阳性+PD-L1阴性；Ⅲ型：PD-1阴性+PD-L1阳性；Ⅳ型：PD-1阴性+PD-L1阴性。采用Kaplan-Meier对4种组合进行生存分析，结果表明：Ⅱ型患者OS最长，Ⅲ型OS最差。尽管有临床研究报道了免疫细胞[21]和肿瘤细胞[22]PD-L1不同的预后价值，但均未能充分证明其生物标记物意义[23-24]，而我们通过对PD-1及PD-1L组合的方法可以更加准确地评估EC的预后，进一步证实了PD-1及PD-1L作为EC预后的生物标志意义。

3.3 EC相关PD免疫治疗

近年来，TME成为肿瘤治疗学研究的热点[25]。PD-1是属于T细胞受体CD28家族免疫检查点受体，其配体PD-L1在TME中被激活，有助于抗肿瘤免疫逃避[25]。针对PD-1/PD-L1途径的单克隆抗体在非小细胞肺癌、肾细胞癌和错配修复缺陷相关结直肠癌显示出很好的疗效[20,22,26]。免疫检查点抑制剂可诱导T细胞活性恢复,释放抗肿瘤免疫反应[25,27]。肿瘤进展是肿瘤侵袭和宿主免疫防御失衡的结果[28]，肿瘤进展过程中往往伴随着免疫细胞或免疫因子的变化[29]，而越来越多的研究表明：一些免疫标记物较TNM分期更有预测价值[30]。

目前可用于PD-1抑制剂疗效预测的分子标志物有：1)PD-L1表达水平；2)微卫星不稳定和基因错配修复缺陷；3)肿瘤突变免疫负荷检测；4)肿瘤浸润淋巴细胞表达。Pembrolizumab在多种肿瘤类型中表现出强大的抗肿瘤活性和良好的安全性，60多个国家已批准其应用于晚期恶性肿瘤的治疗，KEYNOTE-028研究发现Pembrolizumab应用于晚期EC患者维持治疗的疗效满意[31]，为靶向治疗提供了重要参考。本研究中PD-1与PD-L1在EC中表达情况的组合分析，不仅具有指导预后的意义，而且对于靶向治疗的选择也具有一定的指导意义。

3.4 研究的优势及局限性

本研究结果显示EC组织中PD-1/PD-L1单克隆抗体显示出良好的反应性，明确了EC组织中PD-1高表达的生存获益和PD-L1表达对预后的不良影响，为EC的预后提供了重要参考；此外，本研究通过对PD-1、PD-L1蛋白的表达组合后进行生存分析，进一步发现PD-1阳性+PD-L1阴性组患者预后最好，而PD-1阴性+PD-L1阳性者预后最差，不仅提供预后信息，也为EC靶向治疗提供了重要参考，为其他相关研究提供了新的研究思路。局限性：样本均取自初次行手术治疗的EC患者；没有研究子宫内膜上皮内瘤变及复发性EC；没有评估PD-1/PD-L1在子宫内膜不同病变状态的演变；由于样本量少，未深入探讨PD-1、PD-L1在II型EC中的意义；未对淋巴细胞进一步标记，无法判断肿瘤间质中染色的免疫细胞是否为TIL；目前用于预测免疫治疗疗效的分子标志物还有：MSI、dMMR、TMB及TIL表达，但本研究未对其他分子标志物进行检测，无法和其他因子进行对照。

总之，EC中PD-1/PD-L1的深入研究，有助于筛选适当的EC患者进行免疫治疗，使他们得到更好的生存获益。

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