RNA药物非病毒递送系统研究进展

陈欢，魏利军

（哈药集团股份有限公司产品立项部 北京 100023）

DNA双螺旋结构以及中心法则被发现后，人类就设想着通过对遗传信息的干预来治疗疾病。随着遗传学的不断发展，尤其是人类基因组测序工作完成后，疾病与基因之间的关系逐渐清晰，将遗传物质作为治疗靶点已成为现实[1]。目前已上市核酸治疗产品包括针对DNA的药物或疗法（含体外改变基因的细胞疗法）、针对RNA的药物以及核酸适配体。核酸药物中与DNA有关的药物分类众多，涉及的技术领域庞杂。基于DNA的疗法需要对遗传物质产生永久性变化，存在将外源性基因整合入患者基因组的风险；另外，其需要进入细胞核才能发挥作用，提高了应用难度。相对而言，RNA类药物易于生产和递送、具有较高的安全性，20余年来已取得了引人瞩目的成果。本文主要针对RNA，包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、信使RNA（mRNA）以及微小RNA（miRNA）[2]的药物递送系统研究进展进行综述。核酸适配体和CpG寡聚核苷酸通过特定结构特征而非本身序列特征进行识别，不纳入本综述范围。

自福米韦生于1998年上市以来，迄今共有15款针对RNA的药物上市。近年来，随着技术日趋成熟，此类药物的发展明显有加速趋势。2015年前仅有3款药物上市，而2018年至今不足4年时间，已先后有12款药物上市。

RNA药物的发展不限于技术的进步，其市场表现也相当亮眼。2016年上市的用于治疗脊髓性肌萎缩的药物诺西那生钠（商品名：Spinraza）的年销售额自2018年起已连续4年超过10亿美元，成为本领域首个“重磅炸弹”级药物。2020年，新冠病毒导致的全球疫情促使辉瑞/BioNTech合作开发的疫苗BNT162b2（商品名：Comirnaty）和Moderna开发的疫苗mRNA-1273（商品名：Spikevax）于当年12月相继获得FDA紧急使用授权，用于预防新冠病毒感染。财报显示，Comirnaty和Spikevax在2021年全球总销售额分别高达368亿美元[3]和177亿美元[4]。

根据沃森-克里克碱基配对规则，核酸药物只需针对目标基因适当地重新排列核酸的碱基序列，就有望开发成具有生物特异性的药物，避免了研发过程中的盲目性。在确定靶标序列后，优化设计核酸药物的序列筛选耗时也远低于小分子化合物和抗体的筛选。相较于抗体药物，核酸药物不仅候选靶点更丰富，100个碱基以下的核酸药物通常可以进行化学合成，更容易保证批次间稳定性和进行质量控制。核酸药物的独特优势使其有望成为继小分子和抗体之后的第三大类型药物。

然而，核酸要进入体内发挥作用却要面对多重障碍：首先，核酸药物易被血浆和组织中RNase酶降解，并易被肾脏快速清除；其次，核酸具有天然的免疫原性，进入体内后易引起免疫反应；另外，核酸药物的相对分子质量和负电荷让其不能自由通过细胞膜；最后，核酸药物进入细胞后易被“卡”在内吞小体中无法发挥功能。所以，自核酸药物诞生以来，其开发过程中的主要问题一直是如何有效地对其进行递送[5]。

解决核酸药物的递送有2种思路，一种是对核酸结构进行改造，使其性质稳定并躲避免疫系统的识别；另一种是利用药物递送系统。

不同于小分子化合物其药理学和药动学性质均由分子结构决定，核酸药物的药理学性质更多地由核酸序列决定，而药动学性质更多地由化学修饰的骨架和配体决定。这使得可以在不改变核苷酸序列的前提下，对核酸药物进行化学改造，从而对其药动学性质单独进行优化[6]。目前已有多种成功的修饰方案，如磷酸连接基团中的一个氧换成硫和糖环2位修饰等。改造核酸分子需要从多方面进行考虑，主要包括分子稳定性、药动学性质、碱基配位亲和力，以及避开免疫系统等。因为ASO、siRNA和mRNA等药物都需要在各种酶[如核糖核酸酶（RNase）、Argonaute 2蛋白（Ago 2）和RNA聚合酶]的作用下才能发挥作用，还必须确保修饰后能够被相关的功能酶所识别[7]。

化学修饰可以在一定程度上提高核酸药物的化学稳定性、降低免疫原性，但并不能完全解决其跨膜问题，多种针对核酸药物的递送系统应运而生。递送系统可以分为病毒载体和非病毒载体两类，病毒载体一般使用基因修饰的病毒，如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等，其递送效率高并可以产生持续性的治疗效果，而且可以将核酸药物递送至细胞核，这对于以DNA为靶点的药物至关重要。病毒载体的主要劣势在于其可能将病毒的基因组插入患者染色体，安全性存在争议。另外，免疫原性、较小的包装容量、高生产难度均在一定程度上限制了其使用[8]，目前大部分获批上市的核酸治疗药物均采用非病毒载体。其中，使用度较高的有脂质纳米颗粒递送系统、生物偶联递送系统以及外泌体（exosome）载体几类。

1 脂质纳米颗粒递送系统

基于脂质的纳米载体是核酸药物递送领域的研究热点。脂质本身即是细胞膜的主要成分，其易于与细胞膜的磷脂双分子层相融合，可以提高纳米载体的细胞摄入。而且，脂质易于购买、生物相容性好、可生物降解，还可以通过化学修饰提高载体靶向性。目前研究涉及的脂质纳米载体包括脂质复合物（lipoplex）、脂质聚合物复合物（lipopolyplex）、层状纳米颗粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carrier，NLC），以及稳定的核酸脂质粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

1.1 脂质复合物

通过电性吸引将核酸药物与阳离子脂质[如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA）等]混合后直接形成脂质复合物是最简单的递送思路。脂质复合物的表面带正电荷，便于结合带负电荷的细胞膜继而进入细胞[9]，但其在体内环境中会不可避免地与带负电荷生物大分子发生作用，导致带负电荷的核酸药物被置换从而发生泄漏，同时产生电荷相关的生理毒性[10]。另外，脂质复合物剂型稳定性不理想，需要在使用前即时配制。

1.2 脂质聚合物复合物

脂质聚合物复合物系将阳离子聚合物[如聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺树形分子（PAMAM dendrimer）等]与核酸药物形成的表面带正电的聚合物复合物通过电性吸引包裹脂质双分子层得到，形成的纳米颗粒表面基本不带正电荷。相较于脂质复合物，脂质体聚合物复合物可以显著提高递送效率，且稳定性明显提高[11]。通过加入透明质酸或肝素对复合物表面进行修饰，其免疫刺激性可进一步降低[12]。

1.3 层状纳米颗粒

层状纳米颗粒通过序列的电性作用将核酸药物包裹进多层的纳米颗粒。中心稳定的纳米核心及各层材料的选择对相邻层之间的吸附至关重要。Choi等[13]使用电负性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）颗粒作为核心，首先将聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以产生带正电荷的表面，再以电负性的siRNA进行覆盖，再覆盖一层带正电荷的聚精氨酸，最后用偶联了CD20抗体的带负电荷的透明质酸覆层。该多层纳米颗粒最外层的负电荷层可以避免产生正电荷相关毒性，其在动物实验中未见明显的毒性。但层状纳米颗粒的材料选择要求较高且制备工艺复杂、重现性差，限制了其应用。

1.4 固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体

固体脂质纳米粒具有低熔点的固体阳离子脂质核心，核酸药物吸附于载体基质表面，通过外围的表面活性剂使之稳定。但研究发现，SLN可能会随着内部固体脂质晶体的逐渐生长导致药物泄漏[14]。纳米结构脂质载体为其升级版本，在基质中掺入少量的液体脂质，降低了脂质核心的结晶程度，不仅提高了载药量，还具有更好的物理和化学稳定性[15]。由于固态脂质核也可进行载药，固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体可以对亲脂性药物进行递送。使用固体脂质纳米粒对Bcl-2 siRNA和紫杉醇同时包载，体外结果显示这2种药物可以同时释放[16]。

1.5 稳定的核酸脂质粒子

SNALP是一种含有可离子化阳离子脂质的脂质纳米粒（LNP），由可离子化脂质、结构脂质、PEG脂质及胆固醇组成，可有效阻止核酸药物在内源性环境中的降解，将药物递送至细胞内[17]。基于其技术和商业上的成功导致的巨大影响，许多文献中的LNP均特指SNALP。目前，已有3个使用此类递送系统的产品获批上市，分别为阿尼拉姆公司开发的治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）的siRNA药物patisiran（商品名：Onpattro），以及用于预防新冠病毒感染的mRNA疫苗Comirnaty和Spikevax。

可离子化阳离子脂质的使用和微流控混合技术[18]的出现使得载药颗粒的表面基本不带电。可离子化阳离子脂质在酸性条件下带正电荷，而在体内循环系统的环境中几乎不带电。脂质纳米粒制备时，在pH约4的条件下，通过快速混合脂质的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成实心的脂质颗粒。将其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存备用，脂质颗粒表面近中性[19]。

SNALP对肝细胞的高亲和力通过载脂蛋白E（ApoE）实现。PEG脂质解离后，ApoE可吸附在SNALP表面，形成高效靶向的配体，与肝细胞表面的脂蛋白受体结合，触发胞饮而被内摄[20]。SNALP通过胞饮进入靶细胞后，内涵体膜上内向的质子泵作用导致内涵体中的pH值降低。可离子化的阳离子脂质逐渐被质子化而带正电荷，内源性的阴离子脂质与阳离子脂质结合，形成锥形结构，破坏双层脂质膜结构，导致核酸药物被释放入胞质，继而发挥作用[21]。但研究显示，内涵体逃逸的时间窗口很短，只有很少一部分SNALP可以从内涵体中逃逸，从而影响了药效的发挥[22]。

目前，可离子化阳离子脂质是SNALP研究的热点。对其优化可以获得更好的治疗效果。在Onpattro的研发过程中，通过不断的优化，在合成了300多种阳离子脂质并进行试验后，可离子化阳离子脂质的优选解离常数（pKa）为6.2 ～ 6.5左右。该pKa范围既可以保证在内涵体pH值下，大部分脂质可被质子化而与内源的阴离子脂质作用，导致内涵体的破裂；同时又可以保证在循环系统中LNP表面基本不带电荷，不被免疫系统清除。最终，Onpattro制剂中使用了DLinMC3DMA，其结构与DLin-KC2-DMA接近，且pKa均为6.4，可以使治疗效果提高10倍[19]。Spikevax和Comirnaty制剂中使用的可离子化阳离子脂质分别为SM-102和ALC-0315。不同于DLinMC3DMA，二者在脂质疏水性尾部中掺入了酯基结构，该结构的引入使脂质能更快地在体内代谢清除，提高了产品的耐受性。同时，二者分枝状尾部的结构设计使得在内涵体逃逸过程中更易于形成锥形结构，便于核酸药物进入胞质[23]。

在脂质纳米粒中加入PEG脂质，可使SNALP大小在100 nm以下，其粒径可进一步通过调整PEG脂质和结构脂质的比例实现。使用PEG脂质的一个问题是其会抑制SNALP与ApoE的结合，从而影响其跨膜转运。使用含有肉豆蔻基的PEG脂质解决了该问题：在颗粒的形成和药品储存期间，此类脂质会聚合于LNP表面；而在生理状态下，其可以逐渐解离，从而形成无包裹的颗粒被细胞摄取[24]。目前已上市产品中，Onpattro使用的PEG脂质为PEG2000-C-DMG，Spikevax和Comirnaty中使用的则分别是PEG2000-DMG和PEG2000-DTA（ALC-0159）。上述3个LNP产品由基本相同比例的4种脂质组成，但含siRNA和mRNA的LNP中可电离脂质氮与寡核苷酸磷酸的物质的量的比值分别为3和6。由于含mRNA的LNP的上述比值明显大于siRNA，二者形成的SNALP在结构上存在一定差异。研究显示，mRNA在SNALP中更靠近中心，而siRNA更靠近表面。而且，载mRNA的SNALP中会形成含有溶剂的小泡，且mRNA在小泡中可能会与带正电荷的脂质分离[25]。

SNALP通过一系列巧妙的设计获得了商业上的成功，但其存在的问题也比较明显。首先，其递送效率有限，为达到治疗效果需要较高的给药剂量。但是，作为一种使用了多种脂质辅料的注射剂，辅料的毒性不可忽视。另外，PEG脂质被报道可引起超敏反应，阳离子脂质也具有一定的促炎性。例如，Onpattro在注射之前需要使用抗组胺药和激素药物控制[26]。随着同样靶向肝脏的更高效递送系统——N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶联递送系统的出现，SNALP已逐渐退出siRNA递送领域。但对于生物利用度更差、荷电更高的mRNA及CRISPR基因编辑药物，LNP递送系统目前仍是解决其递送难题最有效的方式。

本文所述脂质纳米载体中，SNALP不论在技术还是商业上均最为成熟。脂质聚合物复合物协同了脂质复合物的高稳定性、可接受的细胞摄入以及聚合物复合物粒径均匀可控、高转染效率、内涵体逃逸的优势，也是目前研究较为集中的一类载体，但由其聚合物低生物相容性引发的细胞毒性仍是阻碍其进一步发展的主要原因。随着对脂质纳米载体生物学功能、其发挥作用关键限速步骤的深入研究和逐步理解，很有可能会出现进一步完善的药用材料或纳米颗粒形式[11,27]。

2 生物偶联递送系统

目前已上市的基于生物偶联递送系统的产品使用的均为GalNAc偶联递送系统。人类去唾液酸糖蛋 白 受 体（aslaloglyeoprotein receptor，ASGPR）主要表达在肝实质细胞中，人体肝实质细胞表达的ASGPR数量约为50万个。GalNAc可与ASGPR发生特异性结合，利用此特性可以将GalNAc与核酸药物偶联并进行肝脏靶向递送。GalNAc偶联物与ASGPR结合后，通过细胞内吞作用进入内涵体，随着内涵体成熟过程中伴随的酸化，GalNAc偶联物与ASGPR解离，GalNAc在溶酶体中降解从而将核酸药物带入细胞内，ASGPR重新循环至肝细胞表面。GalNAc偶联物的递送非常高效，ASGPR单次循环时间约15 min，1个ASGPR可以循环使用约200次[5,28-29]。由于肝脏的血流量大且含有有孔内皮，注射1次偶联药物后可以充分摄取并维持数月的效果。

GalNAc-siRNA通过细胞表面的ASGPR被网格蛋白包被小泡摄入，转运至内涵体。随着核内涵体pH值 降 低，GalNAc-siRNA从ASGPR释 放，ASGPR循环至细胞表面。GalNAc-siRNA一直存在于成熟的内涵体中。尽管摄取和递送至内涵体较快，但研究显示，在内涵体中只有不到0.01%的GalNAc-siRNA进入胞质[5]。因此，内涵体逃逸是此种递送方式的限速步骤。

目前主要有2种策略用于多价GalNAc共轭物的合成。一种是在固相载体上预组装一个多价GalNAc配体，而后与核酸药物连接，阿尼拉姆的产品开发即基于此种策略[30]。基于树枝状分子骨架的GalNAc配体与ASGR的亲和力取决于糖基的结构、数量，以及糖基和树枝状结构分支点之间间隔子的疏水性和长度。ASGPR对末端GalNAc的亲和力比半乳糖高大约50倍；当间隔子长度为2 nm时，共轭物对核酸的转运效果最好；三触角和四触角GalNAc设计相对于其他设计更加有效[31]。另一种则是在固相合成寡聚核苷酸的过程中基于单价GalNAc亚磷酰胺的多步掺入。该方法允许更灵活的设计和价位，而且合成步骤更少，其可以快速验证不同设计策略及连接子[32]。使用线性多价聚合策略，Dicerna公司开发了基于GalXC平台的siRNA药物。在该独特平台上，折叠的四核苷酸环结构用于连接siRNA的2条链。每个核苷酸上通过2'位连接1个GalNAc，可最多接4个GalNAc。

使用LNP递送系统的第1个核酸药物Onpattro上市后，阿尼拉姆公司却并没有将其已相对成熟的LNP技术用于其他核酸药物的递送，而是将研发重点转向GalNAc偶联递送系统。一方面，这是由于阿尼拉姆并不独立拥有LNP递送平台的知识产权，该平台的大部分专利技术由外部授权获得。但更主要的原因在于GalNAc偶联核酸药物更好的市场前景。以治疗hATTR的药物vutrisiran（商品名：Amvuttra）为例，其相较于Onpattro的静脉注射，使用皮下注射的给药方式；相较于Onpattro每3周1次的给药频率，vutrisiran给药频率降至每3个月1次，具有明显的优势。在一项名为HELIOS-A的Ⅲ期临床研究中，与安慰剂组相比，vutrisiran组患者主要评价指标呈统计学显著性改善。相对于patisiran对照组，vutrisiran组实现了血清转甲状腺素蛋白（TTR）水平的快速和持续降低，较基线平均降低88%，达到非劣效性标准[33]。目前，全球已有5个使用GalNAc偶联递送系统的siRNA药物上市，均由阿尼拉姆公司开发，分别为治疗急性肝卟啉症（AHP）的givosiran（商品名：Givlaari）、治疗原发性高胆固醇血症的inclisiran（商品名：Leqvio）、治疗原发性高草酸尿症1型（PH1）的lumasiran（商品名：Oxlumo），以及上述治疗hATTR的药物vutrisiran。

由于GalNAc偶联递送系统的高靶向性，此前使用直接给药的ASO类产品目前亦开始使用此类技术递送。研究显示，未偶联的ASO主要（高于70%）被肝脏的非实质细胞摄取，而使用三触角GalNAc树枝状结构偶联的ASO则大部分被递送至肝实质细胞。此种递送结果的变化导致体内药效提升约60倍[34]。目前Ionis公司已有多个使用GalNAc偶联递送系统的ASO类药物进入临床。

不同于LNP由药用辅料引起的毒性，GalNAc偶联药物的主要副作用在于其肝毒性。这主要来源于其寡聚核苷酸及代谢物在细胞内的积聚以及其引发的脱靶效应[35]。随着GalNAc偶联物有效性的提高，如何降低其副作用已成为近期的研究热点。

研究人员通过锁核酸（LNA）技术修饰的寡核苷酸来控制GalNAc-siRNA的作用持续时间。REVERSIR是一种与siRNA种子区互补的LNA修饰的寡核苷酸，与GalNAc-siRNA具有高结合力，1次皮下注射TTR-siRNA对应的REVERSIR后可在小鼠中逆转TTR-siRNA引起的反应，从而控制TTR-siRNA作用的时间[36]。乙二醇核酸（glycol nucleic acid，GNA）是一种非环核酸，采用GNA修饰的核酸结合力明显低于天然核酸。在siRNA的反义链的7位和8位（种子区）进行GNA修饰可以在不削弱活性的基础上降低脱靶效应[37]。混合骨架（mixed backbone，MBB）即将硫代磷酸骨架部分替换回正常的磷酸骨架。MBB-ASO的设计具有降低ASO与特定细胞蛋白结合引起的不依赖于杂交的毒性的潜力。研究发现，相对于全PS设计，GalNAc共轭的MBB-ASO表现出相似或提升的活性，这为同时降低毒性和提升活性的化学设计提供了另一种思路[38]。

目前，生物偶联递送系统的研究已扩展到了肝脏外的其他组织，偶联配体包括脂质、多肽、抗体，以及核酸适配体，多项研究已取得令人鼓舞的结果。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体（GLP-1R）在胰腺β细胞上表达，使用GLP-1R偶联ASO在体内和体外均能成功地将ASO递送到胰腺β细胞，且没有影响肝脏和其他组织中相关的基因的表达，具有较好的组织和细胞选择性[39]。转铁蛋白是一种可结合铁离子的糖蛋白，其通过转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR，也称CD71，显著表达于骨骼肌和心肌中）将铁离子转运至细胞内。将抗CD71抗体的Fab段直接与修饰后的靶向肌肉生长抑制素的siRNA偶联，对小鼠静脉注射给药后，其在心肌和骨骼肌中均显示出沉默效果[40]。胆固醇偶联的siRNA已被用于沉默肝脏中编码Apolipoprotein B的mRNA[41]以及小鼠骨骼肌中编码myostatin的mRNA[42]。HIV转 录 激 活 蛋 白（trans-activator protein，Tat）是一种细胞穿透肽，可运载外源性物质进入细胞，其与siRNA偶联后可显著提高siRNA的递送能力[43]。

3 外泌体载体

外泌体是细胞外囊泡中最小的一类，大小约40 ～ 150 nm，是由细胞内多泡体（multivesicular body，MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。研究发现，机体内大多数细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。外泌体携带有宿主细胞的蛋白质、脂质和核酸等物质，可以被目标细胞自然吸收，是细胞间信息交换和物质运输的媒介。外泌体结构类似于单层脂质体，含有围绕于水性核的两亲性脂质双分子层。目前已在外泌体中发现的核酸类物质包括mRNA、miRNA及病毒RNA、tRNA等多种RNA[44]。

作为天然的细胞间信息载体，外泌体较人工递送载体具有明显的优势。首先，外泌体的脂质双分子层结构和较小的尺寸使其可以跨过包括血脑屏障在内的主要的生物屏障。其次，外泌体生物相容性好，不会引起免疫反应。再次，相比于脂质对亲水性物质较低的包封率，外泌体的包装效率显著提升。最后，不同来源的外泌体对受体细胞的选择性不同，通过选择合适来源的外泌体，可使其成为高选择性的递送工具。相比于目前已较为成熟的LNP和GalNAc偶联递送系统，外泌体在非肝靶向的核酸药物递送方面具有良好的应用潜力[45]。

目前尚无上市的外泌体产品，但许多关于核酸药物外泌体递送的研究已取得令人鼓舞的成绩，其递送的核酸药物包括siRNA、miRNA、mRNA等。Wahlgren等[46]将外源性丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）siRNA导入不同的人源血浆外泌体中，发现外泌体可将siRNA递送至人单核细胞，并引发MAPK-1基因沉默。Munoz等[47]发现，通过转染间充质干细胞的方法，使外泌体载有抗miRNA-9寡核苷酸（anti-miR-9）后，可通过外泌体向多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞传递anti-miR-9。Tsai等[48]将编码SARS-CoV-2刺突蛋白和核壳体蛋白的mRNA载入外泌体，进行肌肉注射后，发现该外泌体可诱导小鼠对二者持久的体液和细胞免疫。

目前，已有多个外泌体产品进入临床研究阶段[49]。在一项临床试验（NCT03608631）中，含有靶向KrasG12D突变基因的siRNA的间充质干细胞外泌体正被用于治疗胰腺癌。而伊斯法罕医科大学的临床研究（NCT03384433）正在探索携带miR-124的间充质干细胞外泌体对缺血性心脏病的治疗作用。Codiak BioSciences发现了2种高度丰富的外泌体蛋白PTGFRN和BASP1，使用这些蛋白质作为支架可将感兴趣的治疗性分子引导到外泌体的表面或内腔。其表面荷载ASO的外泌体疗法exoASOSTAT6可选择性靶向肿瘤相关巨噬细胞（TAM）并精确破坏STAT6信号传导，在癌症模型动物中产生显著的抗肿瘤活性[50]。目前在该领域已涌现出一批创新型公司，如Codiak BioSciences、EVOX Therapeutics、Tavec Pharmaceuticals、Carmine Therapeutics、Anjarium and Micromedmark Biotech等；而如罗氏、礼来、武田等大型跨国药企则通过与之合作，进入了这条赛道。

将核酸药物载入外泌体的方法主要分为2类。一类先通过适当手段对外泌体进行纯化，再将核酸药物负载到纯化后的外泌体，如电穿孔法、孵育法、超声法等。此类方法相对简单，但装载效率低且不易控制。由于母细胞及外泌体类型的不同，即使相同装载方法的装载效率也会存在较大的差异，而且载入过程中可能会破坏膜蛋白的天然生理功能。据报道，电穿孔法可能会引起外泌体及siRNA的聚集。另一类则通过对产生外泌体的母细胞进行转染，使其直接产生包含核酸药物的外泌体。使用该方法除装载目标药物外，还可以对外泌体表面结构进行优化，使其具有更好的靶向性。已有多项研究成功使用该方法将母细胞中的miRNA高表达后转染至外泌体，未来该方法可能成为外泌体装载核酸药物的主流选择[51]。

尽管外泌体作为药物递送载体优势明显，其临床应用目前仍存在诸多需要克服的障碍，如外泌体的纯化、分析、规模化生产，以及核酸药物（尤其是相对分子质量较大的mRNA）的载入、外泌体进入靶细胞后如何避免溶酶体降解等[52]。

4 结语

经过近半个世纪的积累，递送技术逐渐成熟，使核酸药物进入了快速增长期。核酸药物在治疗遗传性疾病方面具有天然优势，为众多罕见病患者提供了宝贵的治疗机会。用于治疗成人原发性高胆固醇血症或混合性血脂异常的siRNA药物inclisiran的获批标志着核酸药物在技术上已逐渐获得了监管机构的进一步认可，进入了对安全性要求高但市场更为广阔的慢病领域。核酸药物递送技术的发展呈现出平台化的特点，在递送技术相对成熟后，基于相同技术平台开发类似药物的速度会明显加快。借助前期脂质纳米粒的技术沉淀，Moderna公司的mRNA新冠疫苗从疫苗序列选择设计完成到首次人体给药，合计仅耗时63 d，展现了超乎以往想象的效率[53]。可以预见，已有的技术平台未来也非常有希望应用于体内基因编辑等新的治疗领域。

同时，核酸药物的递送仍面临众多技术挑战。如何进一步提高递送效率、降低递送系统的毒性、实现对其他肝脏外组织和器官的特异性递送将是该领域的研究热点。伴随着对核酸体内作用机制和相关疾病认识的进一步深入，核酸药物递送系统必将迎来新的突破和发展，助力于提供安全有效的个性化治疗方案，使更多患者受益。