比浊法测定饲料添加剂中重金属限量的研究

商 军，曹 莹，田 恺，张浩然，华贤辉，徐 汀，张亦菲

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

化学上根据金属的密度把金属分成重金属和轻金属，常把密度大于5 g/cm3的金属称为重金属，如：金、银、铜、铅、锌、镍、钴、铬、汞、镉等大约45种。从环境污染方面所说的重金属是指：汞、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属；对人和动物毒害最大的有5种：铅、汞、铬、砷、镉。砷虽然不是金属，但是因为其毒性和重金属类似，也被列为重金属[1-3]。铅是饲料添加剂中较易引入的重金属元素，且易蓄积中毒，故国内外重金属限量试验均以铅(Pb)的限量作为重金属的代表。目前，在制修订饲料添加剂标准中所引用的重金属限量试验方法均不统一，不能科学地界定饲料添加剂重金属污染和超标情况。由于饲料添加剂是饲料的核心，饲料添加剂重金属污染和超标情况将直接影响饲料产品的质量安全，为此，有必要制定饲料添加剂中重金属限量试验标准来规范和统一重金属限量试验方法(农业行业标准制修订项目编号：2019-合同-14)。

目前国内外重金属限量试验的方法大都采用硫化物比浊法，即加入沉淀剂提供S2-，与试样中的重金属产生金属硫化物均匀混悬液，以铅(Pb)为限量进行比色判定。选用显色剂主要有3种：硫代乙酰胺溶液、硫化钠溶液和硫化氢饱和溶液[4-12]。由于硫化氢饱和溶液污染严重，制备繁琐，且新鲜制备的硫化氢饱和溶液具有强烈的腐蛋臭味，毒性极大，会使人的中枢神经系统中毒，产生头昏、恶心、呕吐现象，重者丧失意识、昏迷、窒息甚至死亡。为此，本研究采用毒性小、污染少、制备方便的硫代乙酰胺溶液和硫化钠溶液作为显色剂。与此同时，由于《饲料添加剂品种目录》中收载的饲料添加剂品种繁多，为此，根据饲料添加剂的化学性质，选择使用不同试样预处理方法，分别研究了对饲料添加剂中重金属进行测定的硫代乙酰胺比浊法和硫化钠溶液比浊法，使制定的方法能适用于多数饲料添加剂品种。

1 试验材料

1.1 仪器

UV-2550紫外-可见分光光度计，带1 cm石英比色皿，岛津企业管理(中国)有限公司；AB135-S电子天平，精度为0.01 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；M104箱式马弗炉，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；ED56电热干燥箱，德国Binder公司；SLK 2红外线加热板，维根技术(北京)有限公司；数显台式酸度计：精度为0.01 pH单位，上海雷磁仪器有限公司；纳氏比色管：规格25 ml，选外表面无划痕，色泽一致，无瑕疵，管的内径和刻度线的高度均匀一致的质量好的玻璃比色管；Molatom 1810A纯水机，中国重庆摩尔水处理设备有限公司。

1.2 试剂

盐酸、硝酸、氨水(NH3·H2O)、硫代乙酰胺、硫化钠、氢氧化钠、乙酸铵、酚酞：均为分析纯，永华科技(江苏)有限公司；硝酸铅，高纯，纯度为99.99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；铅标准溶液(1 000 mg/L)，有证单元素标准溶液；实验用水，GB/T 6682中规定的三级水；氢氧化钠溶液，取氢氧化钠4.3 g，加水溶解成100 ml，即得，临用现配；盐酸溶液(7 mol/L)，取盐酸63 ml，用水稀释至100 ml，混匀，即得；盐酸溶液(2 mol/L)，取盐酸18 ml，用水稀释至100 ml，混匀，即得；氨溶液(5 mol/L)，取氨水40 ml，用水稀释至100 ml，混匀，即得；混合液，取氢氧化钠溶液15 ml、水5.0 ml及甘油20 ml，混合均匀，即得，临用现配；硫代乙酰胺储备溶液，取硫代乙酰胺4 g，加水溶解成100 ml，于4℃冷藏保存，有效期为1个月；硫代乙酰胺溶液，临用前取混合液5.0 ml，加硫代乙酰胺储备溶液1.0 ml，置98～100℃水浴上加热20 s，冷却，临用现配；硫化钠溶液，取硫化钠l g，加水溶解成10 ml，即得，临用现配；pH3.5的乙酸盐缓冲液，取乙酸铵25 g，加水25 ml溶解后，加7 mol/L盐酸溶液38 ml，用2 mol/L盐酸溶液或5 mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(pH计指示)，用水稀释至100 ml，即得；稀焦糖溶液，取蔗糖或葡萄糖约5 g，置瓷坩埚中，在玻璃棒不断揽拌下，加热至呈棕色糊状，放冷，用水溶解成约25 ml，过滤，贮于滴瓶中备用；酚酞乙醇溶液，取酚酞l g，加乙醇100 ml溶解，即得；铅标准储备溶液(100 μg/ml)，称取在105℃干燥至恒重的硝酸铅0.159 9 g，准确至0.000 1 g，置1 000 ml容量瓶中，加硝酸5 ml与水50 ml溶解后，用水稀释至刻度，摇匀；或准确移取铅标准溶液10.00 ml，置于100 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，室温下保存，有效期为1个月；铅标准使用溶液(10 μg/ml)，准确移取铅标准储备溶液10.00 ml，置100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得，当日使用；91个饲料添加剂样品来自于市场抽检及企业提供。

2 试验方法

2.1 硫代乙酰胺比浊法

2.1.1直接溶解处理法

2.1.1.1试样处理

取纳氏比色管3支，编号为甲管(标准管)、乙管(试样管)、丙管(监测管)，在测定时，甲管、乙管与丙管平行操作，同时按顺序加入试剂，试剂加入量、操作条件等应一致。在甲管中加一定量的铅标准使用溶液与pH3.5的乙酸盐缓冲液2 ml，摇匀，加水或溶解试样的溶剂稀释成25 ml；称取试样适量，准确至0.000 1 g，置乙管中，加水或溶解试样的溶剂适量使其溶解(若试样中如含有高铁盐，可在甲、乙、丙三管中分别加入相同量的抗坏血酸0.5～1.0 g，将高铁离子还原为亚铁离子消除干扰)，加pH3.5的乙酸盐缓冲液2 ml，摇匀，加水或溶解试样的溶剂稀释成25 ml；丙管中加与乙管相同量的试样，加水或溶解试样的溶剂适量使其溶解，加与甲管相同量的铅标准使用溶液与pH3.5的乙酸盐缓冲液2 ml，然后加水或溶解试样的溶剂稀释使成25 ml。在甲、乙、丙三管中分别加硫代乙酰胺溶液各2 ml，摇匀，放置5 min。

2.1.1.2结果与判定

(1)同置白纸上，自上向下透视，当丙管中显出的颜色不浅于甲管时，乙管中显出的颜色与甲管比较，乙管所呈颜色浅于甲管，判为符合规定。(2)如丙管中显出的颜色不深于甲管，试验无效，应取样重新检查。(3)如乙管中试样溶液略带颜色，在甲管中滴加稀焦糖溶液，仍不能使甲管、乙管、丙管颜色一致时，应取样重新检查。

2.1.2炽灼后处理法

2.1.2.1试样处理

取纳氏比色管2支，编号为甲管(标准管)、乙管(试样管)，在测定时，甲管、乙管应平行操作，同时按顺序加入试剂，试剂加入量、操作条件等应一致。称取试样适量，准确至0.000 1 g，按GB/T 6438进行炽灼处理[13]，取遗留的残渣，加硝酸1～2 ml，蒸干至氧化氮蒸气除尽，放冷，加盐酸2 ml，置水浴上蒸干后加水15 ml，加入酚酞乙醇溶液1滴，逐滴加入氨溶液，边加边搅拌，直到溶液刚显微粉红色，再加pH3.5的乙酸盐缓冲液2 ml，微热，放冷，过滤至乙管中，加水稀释成25 ml；取配制试样溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加pH3.5的乙酸盐缓冲液2 ml与水15 ml，微热溶解后，移置甲管中，加铅标准使用溶液一定量，加水稀释成25 ml。在甲、乙管中分别加硫代乙酰胺溶液各2 ml，摇匀，放置5 min。

2.1.2.2结果与判定

同置白纸上，自上向下透视，甲管与乙管比较，乙管所呈颜色不深于甲管，判为符合规定。

2.2 硫化钠比浊法

2.2.1碱直接溶解处理法

2.2.1.1试样处理

取纳氏比色管2支，编号为甲管(标准管)、乙管(试样管)，在测定时，甲管、乙管应平行操作，同时按顺序加入试剂，试剂加入量、操作条件等应一致。称取试样适量，准确至0.000 1 g，置于乙管中，加氢氧化钠溶液5 ml使其溶解，再加水稀释使成25 ml；取一定量的铅标准使用溶液置甲管中，加氢氧化钠溶液5 ml，再加水稀释成25 ml。在甲、乙两管中分别加硫化钠溶液5滴，摇匀，放置5 min。

2.2.1.2结果与判定

同置白纸上，自上向下透视，甲管与乙管比较，乙管所呈颜色不深于甲管，判为符合规定。

2.2.2炽灼后处理法

2.2.2.1试样处理

除最后“在甲、乙管中分别滴加硫化钠溶液各5滴，摇匀，放置5 min”加显色剂不同外，试样处理方法同“2.1.2.1”项。

2.2.2.2结果与判定

同置白纸上，自上向下透视，甲管与乙管比较，乙管所呈颜色不深于甲管，判为符合规定。

3 结果与讨论

3.1 显色剂的选择

本方法参考了中国药典(ChP 2020年版)[9]、美国药典(USP 35版)[10]、日本药典(JP 17版)[11]及日本食品添加物公定书(第9版)[12]，采用毒性小、污染少、制备方便的硫代乙酰胺溶液和硫化钠溶液作为显色剂来检查饲料添加剂中重金属限量，结果见图1～图3。试验结果表明显色效果明显，便于目视检查。

图1 在弱酸性条件下硫代乙酰胺溶液与不同浓度铅标准溶液(0～40 μg/管)反应图

图2 在碱性条件下硫化钠溶液与不同浓度铅标准溶液(0～40 μg/管)反应图

图3 在弱酸性条件下硫化钠溶液与不同浓度铅标准溶液(0～40 μg/管)反应图

3.2 铅标准使用溶液(10 μg/ml)取用量的确定

为了便于目视比较，本方法硫代乙酰胺比浊法和硫化钠比浊法中的铅标准使用溶液(10 μg/ml)取用量以1.00～4.00 ml为宜，小于1.00 ml或大于4.00 ml呈色太浅或太深，均不利于目视比较，故在检查时，根据铅标准使用溶液(10 μg/ml)的取用量，可适当调整试样的称样量。

3.3 试样预处理方法的确定

3.3.1硫代乙酰胺比浊法试样处理方法的确定

(1)直接溶解处理法。该法适用于在规定的实验条件下，能够溶于水或其他溶剂产生澄清无色溶液的饲料添加剂。ChP 2020年版中第一法、USP 40版中第一法、JP 17版中第一法和日本食品添加物公定书(第9版)中第一法均是采用此法进行测定[9-11]。但本方法中直接溶解处理法与ChP 2020年版中第一法和USP 40中第一法一样均增加了监测溶液，其中含有规定量的标准铅溶液及试样溶液，只有在监测溶液的颜色不浅于对照溶液时该法才有效，否则说明试样的重金属可能处于有机结合状态，应按照炽灼法进行处理。另外，本方法中对试样中如含高铁盐，需在配制的溶液中加入适量的维生素C，因为高价铁离子会与S2-反应析出单质硫，从而影响溶液的显色而干扰测定，加入维生素C可将高价铁离子还原为Fe2+，进而排除其干扰[14-15]。

(2)炽灼后处理法。该法适用于在规定的实验条件下不能形成澄清无色溶液的药物，或者由于性质复杂，易干扰硫离子与重金属离子形成沉淀的饲料添加剂，以及含有芳环、杂环等的饲料添加剂。这些饲料添加剂需经炽灼破坏后进行重金属的检查，按GB/T 6438 进行炽灼处理[13]，取残渣加硝酸、盐酸转化为易溶于水的氯化物后进行检查。实验过程中，炽灼温度控制在550±20℃，若温度在600℃以上时，多数重金属盐都有不同程度的损失。

3.3.2硫化钠比浊法试样处理方法的确定

(1)碱直接溶解处理法。该法适用于溶于碱不溶于稀酸或在稀酸中析出沉淀的饲料添加剂，该法取试样加氢氧化钠溶液和水溶解后，以硫化钠为显色剂，Pb2+与S2-作用形成PbS微粒，与一定量的标准铅溶液同法处理后所呈颜色进行比较。

(2)炽灼后处理法。该法适用于难溶或不溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的饲料添加剂，或受某些因素，如自身有颜色的饲料添加剂、饲料添加剂中的重金属不呈游离状态或重金属离子与饲料添加剂形成配位化合物等干扰的饲料添加剂。这些饲料添加剂需经炽灼破坏后进行重金属的检查，按GB/T 6438进行炽灼处理[13]，取残渣加硝酸、盐酸转化为易溶于水的氯化物后进行检查。实验过程中，炽灼温度控制在550±20℃，若温度在600℃以上时，多数重金属盐都有不同程度的损失。

3.4 显色时间的确定

取硫代乙酰胺溶液和硫化钠溶液作为显色剂采用不同的显色时间，分别对每支纳氏比色管中标准铅含量为0～40 μg的溶液进行显色，以确定硫代乙酰胺溶液和硫化钠溶液的最佳显色时间，结果见表1。试验结果表明，硫代乙酰胺溶液作为显色剂对铅标准系列溶液的最佳显色时间为5 min；硫化钠溶液作为显色剂在碱性环境和弱酸性环境中，对铅标准系列溶液的最佳显色时间均为5 min。

表1 硫代乙酰胺和硫化钠溶液对铅标准溶液不同显色时间的显色结果

3.5 方法学验证

3.5.1线性范围

3.5.1.1硫代乙酰胺比浊法

(1)铅标准比色管系列。取6支纳氏比色管，依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00和4.00 ml，依次分别按“2.1.1.1”项处理，分别制备成0～40 μg/管的铅标准比色管系列。

(2)直接溶解法添加铅标准溶液比色管系列。称取饲料添加剂L-精氨酸约1 g，准确至0.000 1 g，分别置6支纳氏比色管中，加水适量溶解后；依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00 和4.00 ml，摇匀。依次分别按“2.1.1.1”项处理，分别制备成0～40 μg/每管的直接溶解法添加铅标准溶液比色管系列。

(3)炽灼后处理法添加铅标准溶液比色管系列。称取饲料添加剂L-苏氨酸约1 g，准确至0.000 1 g，分别置6只瓷坩埚中，依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00和4.00 ml，混匀。按“2.1.2.1”项处理，分别制备成0～40 μg/管的炽灼后处理法添加铅标准溶液比色管系列。

分别取(1)、(2)、(3)中比色管系列，以0 ml铅标准使用溶液(10 μg/ml)为参比，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以铅含量C为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制工作曲线，结果见表2和图4。试验结果表明，比色反应在0～40 μg/管范围内呈线性，线性关系均大于0.99，且斜率基本一致。

□铅标准比色管系列;○直接溶解法添加铅标准溶液比色管系列;△炽灼后处理法添加铅标准溶液色管系列

3.5.1.2硫化钠比浊法

(1)碱性环境(碱直接溶解处理法)

a)铅标准比色管系列。取6支纳氏比色管中，依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00和4.00 ml，依次分别按“2.2.1.1”项处理，分别制备成0～40 μg/管的铅标准比色管系列。

b)碱直接溶解法添加铅标准溶液比色管系列。称取饲料添加剂丙酸钙约1 g，准确至0.000 1 g，分别置6支纳氏比色管中，依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00和4.00 ml，依次分别加水适量溶解；依次分别按“2.2.1.1”项处理，分别制备成0～40 μg/管的碱直接溶解法添加铅标准溶液比色管系列。

分别取a)、b)中比色管系列，以0 ml铅标准使用溶液(10 μg/ml)为参比，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以铅含量C为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制工作曲线，结果见表2和图5。

试验结果表明，比色反应在0～40 μg/管的范围内呈线性，线性关系均大于0.99，且斜率基本一致。

炽灼后在弱酸性条件下硫化钠比浊法的铅标准曲线比较图见图6。

□铅标准比色管系列;○碱直接溶解法添加铅标准溶液比色管系列

□铅标准比色管系列;○炽灼后处理法添加铅标准溶液比色管系列

(2)弱酸性环境(炽灼后处理法)

a)铅标准比色管系列。取6支纳氏比色管，依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00和4.00 ml，依次分别按“2.2.2.1”项处理，分别制备成0～40 μg/管的铅标准比色管系列。

b)炽灼后处理法添加铅标准溶液比色管系列。称取饲料添加剂维生素D3约1 g，准确至0.000 1 g，分别置6只瓷坩埚中，依次分别加铅标准使用溶液(10 μg/ml)0、0.50、1.00、2.00、3.00和4.00 ml，混匀；依次分别按“2.2.2.1”项处理，分别制备成0～40 μg/每管的炽灼后处理法添加铅标准溶液比色管系列。

分别取a)、b)中比色管系列，以0 ml铅标准使用溶液(10 μg/ml)为参比，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以铅含量C为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制工作曲线，结果见表2和图6。试验结果表明，比色反应在0～40 μg/每管范围内呈线性，线性关系均大于0.99，且斜率基本一致。

表2 硫代乙酰胺比浊法和硫化钠比浊法铅标准曲线的比较测定结果

3.5.2目视检出限的确定

根据重金属限量试验方法的原理，硫代乙酰胺比浊法和硫化钠比浊法能够检测Pb、Bi、Cu、Cd、Sn、Hg等重金属，目前国内外标准中不需要对这些金属进行特异性评估，需对方法的检出限进行目视评估。通过目视检查一系列稀释的标准铅溶液来确定检测限。按本方法分别采用硫代乙酰胺比浊法和硫化钠比浊法制备成7个浓度的试验溶液，每支纳氏比色管中铅含量为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg进行试验，结果见表3。

表3 硫代乙酰胺比浊法和硫化钠比浊法的目视检出限

试验结果表明，硫代乙酰胺比浊法在弱酸性环境中的目视检出限为每支纳氏比色管中铅含量为4 μg；硫化钠比浊在碱性环境和弱酸性环境中的目视检出限均为每支纳氏比色管中铅含量为3 μg。

3.5.3添加重金属试样的目视比浊结果

选取饲料添加剂L-精氨酸、碳酸氢钠和dl-α-生育酚乙酸酯，分别加入重金属Cu 10 μg、Co 5 μg、Cd 10 μg、Ni 5 μg、Hg 10 μg，其中L-精氨酸按“2.1.1.1”项处理、碳酸氢钠按“2.2.1.1”项处理、dl-α-生育酚乙酸酯分别按“2.1.2.1”项和“2.2.2.1”项处理”，结果见图7～图10。

图7 L-精氨酸添加重金属的硫代乙酰胺比浊法测定结果(直接溶解处理法)

图8 碳酸氢钠添加重金属的硫化钠比浊法测定结果(碱直接溶解处理法)

图9 富马酸添加重金属的硫代乙酰胺比浊法测定结果(炽灼后处理法)

图10 富马酸添加重金属的硫化钠比浊法测定结果(炽灼后处理法)

试验结果表明，加入上述重金属后的试样经处理后比浊测定，比浊结果均超过饲料添加剂L-精氨酸(≤10 mg/kg)、碳酸氢钠(5 mg/kg)和dl-α-生育酚乙酸酯重金属限量(≤10 mg/kg))规定的要求，能较好检出重金属污染情况。

3.6 试样测定

为了考察方法适用性，根据收集的饲料添加剂产品的化学性质，按研究的方法对《饲料添加剂品种目录》中收载的11类共计91个饲料添加剂产品中重金属限量进行了测定，试验结果表明，方法适用于《饲料添加剂品种目录》中收载的多数饲料添加剂产品中重金属限量试验。典型的测定结果见表4。

表4 各类饲料添加剂产品中重金属限量试验的测定结果

4 结论

经对重金属限量试验条件的显色剂、试样预处理方法、显色时间、铅标准使用溶液取用量的确定和对重金属限量试验方法的线性与范围、目视检出限、添加重金属试样的目视结果的确认，以及对收集的《饲料添加剂品种目录》中11类共计91个饲料添加剂产品的实际试样测定结果，表明研究的方法适用于饲料添加剂中重金属限量的测定。