脱落酸对苹果柱型基因MdCoL表达的影响

韩婷婷，王鸣枭，张玉刚，孙欣

（青岛农业大学园艺学院／青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东 青岛 266109）

树型结构是影响果树修剪、果实品质和果园管理的一个重要农艺性状。矮化密植是世界上先进苹果产区普遍采用的一种栽培模式，也是我国现代化苹果产业的发展趋势。柱型苹果（Malus×domesticaBorkh.）树体矮小，节间短，腋芽萌发为大量短枝，长分枝少且分枝角度小，生长紧凑，是进行苹果矮化育种的重要种质资源［1－3］。自1960年在加拿大发现柱型突变体‘威赛克旭（Mc-Intosh Wijcik）’以来［4］，其独特的树形生长特性一直备受关注。经典遗传学实验表明，苹果柱型性状是由显性单基因Co控制的质量性状［5］。基因组序列公布之前，AFLP、SSR、RAPD和SCAR等分子标记的筛选与开发已将Co基因定位到了第10号染色体17.0～19.5 cM的范围内［6－11］。2010年苹果基因组数据公布之后，各国研究者通过精细定位、RNA－seq和遗传转化实验证明了MdCoL（91071－gene／MdCo3l／dmr6－like）是调控苹果柱型性状最强有力的候选基因［12－17］。

脱落酸是能够引起芽休眠和叶片脱落、调节植物生长发育的一种倍半萜类化合物，高等植物中主要通过类胡萝卜素途径（也称间接途径）合成，即类胡萝卜素经玉米黄质氧化酶（ZEP／ABA1）、9－顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）和醛氧化酶（AAO）裂解间接形成ABA，NCED是此过程中的关键限速酶［18，19］。近期又有研究发现了一种独立于ZEP／ABA1而依赖于ABA2和ABA3的脱落酸合成支路，该途径更为简洁、保守［20］。ABA的信号转导主要以PYLPP2C－SnRK2－TFs通路为主，通过释放被PP2C抑制的SnRK2激酶激活下游转录因子，从而增强植物对ABA信号的响应，实现其生理效应［21－25］。研究发现，ABI4和OsAP2－39等转录因子在调节植物体内脱落酸、赤霉素和细胞分裂素水平上发挥着重要作用，影响着种子萌发和植株生长发育［24－26］。

前期研究发现，柱型苹果中的ABA含量较普通型苹果高［27］；转MdCoL的苹果‘王林’愈伤中的ABA含量也显著高于野生型对照，其主要通过促进MdNCED6和MdNCED9的表达来促进ABA的生物合成［28］。为进一步研究ABA与苹果柱型基因MdCoL表达及柱型性状的关系，本研究以柱型苹果‘威赛克旭’和普通型苹果‘旭（McIntosh）’的新梢和芽以及本实验室保存的转MdCoL基因的T3代烟草为试材，设置外源ABA及其生物合成抑制剂氟啶酮喷施处理，分析各材料体内MdCoL及ABA生物合成和信号转导相关基因的表达量变化，同时分析外源ABA处理对转MdCoL基因和野生型本生烟表型的影响，以探究柱型性状与ABA的关系，为苹果柱型性状调控机制的完善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

9年生柱型苹果‘威赛克旭’和普通型苹果‘旭’的新梢和芽，取自青岛农业大学胶州农业科技示范园。野生型本生烟（Nicotiana benthamiana）及其转MdCoL株系CoL－5和CoL－15，由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 外源ABA及其抑制剂氟啶酮处理柱型和普通型苹果 选取长势相同的两种类型的苹果树，从中随机挑选新萌发的春梢，分别用0.1 mol／L ABA和10μmol／L氟啶酮喷施新梢和芽至表面充分湿润且无液滴凝聚下落，分别于喷施后1、3、6、12、24 h取样，以喷施5%酒精做0 h对照。每个时间点选取3个枝条作为3个生物学重复，取其新梢和芽，经液氮速冻后于－80℃冰箱保存。

1.2.2 外源ABA处理转MdCoL基因本生烟 选择长势一致、具有6～8片叶的野生型和转Md-CoL本生烟植株，整株喷施80 mmol／L ABA，每隔3 d喷施1次，连续喷施15 d，以喷施5%酒精为对照，设置3个生物学重复。每次喷施前观察记录植株的表型变化，测量株高、节间长、叶绿素含量和叶片数。其中，株高为烟草植株茎基部到生长点的长度，节间长度为上数第3～6节间长度的平均值，叶绿素含量为顶部3片叶的SPAD－502便携式叶绿素仪检测值的均值，叶片数为各植株的叶片总数。

1.2.3 总RNA提取和反转录 总RNA提取参照原平皓（天津）生物技术有限公司的植物基因组RNA提取试剂盒说明书进行。利用1%琼脂糖电泳检测总RNA质量，利用Nanodrop2000紫外分光光度计检测总RNA浓度。RNA的反转录参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行。以反转录得到的cDNA为模板，使用内参基因MdActin或NbActin的引物进行PCR扩增和1%的琼脂糖电泳，检测cDNA质量，选取质量好的样品保存备用。

1.2.4 实时荧光定量PCR 利用Primer Premier 5.0设计MdCoL及ABA生物合成和信号转导相关基因（表1）的引物，引物合成由上海擎科生物科技有限公司完成。以上述cDNA为模板，检测相关引物质量，选取最优引物（表2）进行后续试验。荧光定量PCR反应体系配制按SYBR Green PCR Master Mix说明书进行。以MdActin或NbActin做内参，每组样品3个重复，反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，共44个循环；扩增完全后温度从65℃按0.1 s升温1℃缓慢上升至95℃进行溶解曲线绘制。每次循环第三步进行荧光采集。

表1 ABA生物合成和信号转导相关基因

1.3 数据整理与分析

外源ABA及氟啶酮处理后烟草株高、节间长、叶绿素含量等表型数据及荧光定量PCR数据均通过Microsoft Excel进行处理，采用2－ΔΔCt方法计算基因相对表达量。图表均通过GraphPad Prism 8绘制。

2 结果与分析

2.1 外源ABA对苹果MdCoL及ABA生物合成和信号转导相关基因表达的影响

未经外源ABA处理时，柱型苹果‘威赛克旭’中的MdCoL相对表达量约为普通型苹果‘旭’的6倍；经外源ABA处理6 h后，MdCoL在柱型苹果中明显上调表达，处理12 h后表达量增加至普通型苹果的13倍（图1）。表明相较于普通型苹果，ABA可明显促进柱型苹果中MdCoL的表达。

由图1可知，ABA的受体基因MdPYL9和信号转导相关基因MdABAR、MdSnRK2在经ABA处理后明显上调表达，ABA的生物合成相关基因MdAAO、MdZEP以及NCED家族的MdNCED2、MdNCED4.1、MdNCED6和MdNCED9在经ABA处理后其相对表达量也均有不同程度的上升，而且柱型苹果中上述基因的上调水平明显高于普通型苹果。表明外源ABA处理不仅可以促进ABA的信号转导和生物合成，而且在促进MdCoL基因表达上可能存在一个反馈调节机制。

图1 外源ABA影响苹果中MdCoL及ABA生物合成和信号转导相关基因的表达

此外，对ABA信号转导途径的负调控因子MdWRKY和MdWRKY40进行分析（图1）发现，未经外源ABA处理时，二者在柱型苹果中表达水平低于普通型，与MdAAO、MdZEP、MdNCED4.1、MdPYL9、MdABAR和MdSNRK2在柱型苹果中的相对表达量均高于普通型苹果不同，这可能与柱型苹果较高水平的ABA含量相关。外源ABA处理后，二者在柱型和普通型苹果中均有一定的上调表达，其中，柱型苹果的MdWRKY表达量在处理24 h时略高于普通型苹果，其余时间均低于普通型苹果，而MdWRKY40表达量在处理6 h时明显低于普通型苹果，其余时间均高于普通型苹果，具体还需进一步探究。

2.2 氟啶酮对苹果MdCoL及ABA生物合成和信号转导相关基因表达的影响

10μmol／L ABA生物合成抑制剂氟啶酮对柱型和普通型苹果新梢和芽的处理结果（图2）显示，处理1～12 h内，MdCoL的表达均呈现明显的下降趋势，柱型苹果中下降更明显，表明氟啶酮可抑制MdCoL的表达。处理24 h时，柱型苹果中的MdCoL表达量明显升高，而普通型苹果中仍表达下调，这可能与柱型苹果中较高水平的本底Md-CoL表达量有关，具体原因有待进一步探究。

对ABA生物合成途径相关基因的分析发现，经氟啶酮处理后，MdNCED2在普通型苹果中明显下调表达；MdNCED6在柱型和普通型苹果中均明显下调表达；MdNCED4.1除24 h的表达水平较高外呈现先上调再下调的趋势；MdNCED9表达量在处理后1 h达到峰值，之后呈现下降趋势；MdAAO表达量先下降后上升，在普通型苹果中处理6 h后表达量即开始上调，而在柱型苹果中下调趋势更为明显且表达量未能恢复到未处理时的水平；MdZEP表达量在柱型苹果中先下降后上升，在24 h时表达量急剧上升，但在普通型苹果中变化不明显（图2）。说明氟啶酮可以在一定程度上抑制ABA生物合成相关基因的表达，而且柱型苹果对氟啶酮处理更为敏感。

图2 氟啶酮影响苹果中MdCoL及ABA生物合成和信号转导相关基因的表达

对ABA信号转导相关基因的分析发现，在柱型和普通型苹果中ABA受体基因MdPYL9在氟啶酮处理后均表现出一定程度的上调表达（图2），但变化幅度低于外源ABA处理后该基因的上调表达程度（图1）。信号转导相关基因MdABAR在氟啶酮处理后明显下调表达；MdSnRK2的表达则呈现出先下降再升高的趋势，其中柱型苹果中的表达水平变化相较于普通型苹果更为明显；信号转导途径的负调控因子MdWRKY40表达量在普通型苹果中呈现明显下降趋势，而在柱型苹果中处理3 h后开始下调表达；MdWRKY则在柱型苹果中明显上调表达，在普通型苹果中呈现先上调表达后下调表达的趋势（图2）。说明氟啶酮不仅可以通过抑制ABA的生物合成影响ABA的信号转导，还可能通过负调控因子MdWRKY的高表达来起作用。

2.3 野生型和转MdCoL本生烟中ABA生物合成和信号转导相关基因的表达差异

经外源ABA喷施处理后，ABA生物合成相关基因中，NbAAO、NbVED1和NbNCED1在两个转MdCoL本生烟株系中的表达量均高于野生型，其中NbVED1在转基因株系CoL－5和CoL－15中的表达量分别是对照的9倍和10倍，NbNCED1的表达量分别是对照的36倍和18倍；NbNCED6则在CoL－5中表达量下降，在CoL－15中明显上调表达（图3）。表明MdCoL可上调本生烟中ABA生物合成相关基因的表达，这进一步证明ABA与MdCoL之间存在反馈调节机制。

ABA信号转导相关基因NbSnRK2和受体基因NbPYL9在转基因株系CoL－5和CoL－15中均明显上调表达，且与MdCoL基因呈现相同的表达趋势；NbABAR在CoL－15中明显下调表达（图3）。表明MdCoL还能促进本生烟中ABA的信号转导。

图3 野生型与转MdCoL本生烟中ABA生物合成和信号转导相关基因表达量的差异

2.4 外源ABA对转MdCoL基因本生烟表型的影响

图4结果显示，ABA处理后的15 d内，野生型和转基因株系CoL－5和CoL－15的叶片均发生了一定程度的失绿，其中，野生型失绿最为明显，CoL－5次之，CoL－15变化最小，但对其叶绿素含量的测定均未发现显著差异。外源ABA处理未能改变转基因株系CoL－15的原有表型，但在处理12 d后缩短了转基因株系CoL－5的节间长度，也明显影响了野生型本生烟的表型变化，野生型本生烟在ABA处理3 d后节间开始缩短，在15 d时与对照植株的节间长度差异达到最大。

此外，野生型烟草在ABA处理6天后腋芽萌发，呈现出类似转基因烟草的短分枝现象（图4 e），进一步证明ABA与苹果柱型性状的关系。

3 讨论与结论

ABA通常被认为是一类响应胁迫的植物激素，但也是植物生长发育中的一类负调控激素［29］。本研究结果显示，外源喷施ABA后柱型和非柱型苹果中MdCoL被诱导表达，而ABA生物合成抑制剂氟啶酮处理后的结果与之相反，且柱型苹果反应更敏感，表明ABA可促进MdCoL的表达。此外，前期研究发现转MdCoL苹果愈伤中ABA含量增多［29］。本研究也发现ABA生物合成与信号转导相关基因的表达水平在转MdCoL烟草中均有不同程度的上升，说明MdCoL可以促进ABA的生物合成，且ABA与MdCoL之间存在一个反馈调节机制。

柱型苹果树体矮小，节间短，侧枝生长缓慢，长分枝少，多呈现为大量的短枝，且ABA含量较普通型苹果高［27－29］。本研究对柱型和普通型苹果中ABA生物合成和信号转导相关基因的相对表达量测定分析发现，MdAAO、MdZEP、MdNCED4.1、MdPYL9、MdABAR和MdSnRK2在柱型苹果中表达水平更高，这可能是由于柱型苹果中较高水平的ABA含量导致的。前人研究发现，ABA与水稻株型密切相关，独脚金内酯可促进ABA生物合成关键基因OsNCED1的表达，促进茎基部ABA的生成，进而抑制水稻种子萌发和侧枝生长［30］；油菜素内酯与ABA之间不仅存在拮抗作用，也存在协同交互作用［31，32］；GhCUC2可与GhBRC1互作调控GhNCED1的表达，从而调控内源ABA含量，且过表达GhCUC2棉花的果枝数量减少，长度变短［33］。本研究也发现，ABA处理野生型本生烟可诱导其呈现类似转MdCoL本生烟的“短分枝”表型。以上结果说明ABA能够抑制苹果腋芽的萌发与伸长，进一步证明了ABA与苹果柱型性状的关系。

植物株型是由多种激素共同调控的，如甜瓜矮化基因CmSI可与生长素转运蛋白CmPIN2互作，影响甜瓜茎蔓发育［34］；赤霉素信号转导的关键负调控因子DELLA可协同拟南芥的器官发育基因ATH1共同维持其莲座状株型结构［35］；水稻中HTD12能够影响ABA和BR的生物合成前体类胡萝卜素的合成，通过改变激素含量调节植物株型［36］。本课题组前期研究也发现，MdCoL可促进DELLA蛋白相关基因表达［37］，可能通过赤霉素途径调控苹果柱型性状形成；外源BR处理可下调柱型苹果中MdCoL表达，促进转MdCoL烟草植株的生长［38］。本研究发现外源ABA可促进MdCoL表达，但这些激素之间是否存在相互作用以及它们在调控苹果柱型性状形成中的作用机制还需进一步探究。

综上，ABA可促进苹果中MdCoL表达，二者可能通过一个反馈调节机制共同调控柱型性状形成。