老年性白内障患者circKMT2E表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响△

齐向前 徐志忠 王湘怡 周绮云 马卫国 虎学君

白内障是世界范围内非外伤性视力损害和失明的主要原因[1-2]。老年性白内障(ARC)是白内障的主要类型[3]，ARC的发病机制目前尚不清楚。随着分子生物学与基因测序技术的飞速发展，非编码RNA在疾病发生与发展过程中的作用引起了人们的普遍关注。环状RNA(circRNA)是真核生物中一种不同于传统线性RNA的新型分子，它能稳定保守的闭环结构，是多种疾病的潜在靶点。circRNA在不同物种中起着微小RNA(miRNA)海绵吸附的作用，通过与miRNA竞争性结合，以减轻其对靶mRNA的抑制作用。针对circRNA/miRNA/mRNA基因调控网络的研究，有助于我们加深对ARC发展机制的了解[4]。本研究基于生物信息学分析与细胞实验筛选得到与ARC相关的circKMT2E，探讨circKMT2E在ARC患者中的表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本收集取10例在我院接受白内障手术的ARC患者(男女各5例)晶状体前囊膜，患者年龄 58～82 岁(中位年龄 69 岁)。另选取4例健康捐献者透明晶状体前囊膜(男女各2例)作为对照，捐献者年龄55～79 岁(中位年龄67岁)。所有患者和健康捐献者均无糖尿病和高血压等全身性疾病或其他眼部疾病。

1.1.2 主要试剂及仪器人晶状体上皮细胞系SRA01-04(BNCC340494)购于北京北纳创联生物技术研究院。高糖DMEM培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，引物序列(中国上海生工科技有限公司)，qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，双荧光素酶报告载体、miR-34a-5p、miR-34a-5p mimics、miRNA无序序列、pcDNA3.1-control空载体、pcDNA3.1-HMGB1质粒(中国上海吉玛制药技术有限公司)，LipofectamineTM2000脂质体转染试剂(美国Invitrogen公司)，兔多抗细胞色素C(Cyt-C)、兔多抗B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白、兔多抗Bcl-2相关X蛋白(Bax蛋白)、兔单抗β-actin羊抗兔HRP二抗(美国Abcam公司)，Trizol试剂(美国Life Technologies公司)，实时荧光定量PCR系统(美国TaKaRa公司)。

1.2 circRNA芯片分析

1.2.1 RNA提取、文库制备及测序使用Trizol试剂从人晶状体前囊膜组织中提取总RNA。通过NanoDrop超微量分光光度计测定总RNA浓度，以D260/D280比率(1.8～2.1)作为RNA 纯度的指标。然后去除总RNA中的rRNA，并将纯化后的RNA逆转录为cDNA，并进行 PCR 扩增。最后使用Illumina HiSeq4000平台进行测序。

1.2.2 circRNA芯片数据采集及差异性表达分析依次使用cutadapt软件、DCC软件(v0.4.4)、STAR软件(v2.51 b)、CircBase数据库和circ2Trait数据库对所测得的circRNA进行注释。随后使用edgeR软件(v3.16.5)对数据进行归一化，筛选circRNA差异表达。使用F检验比较ARC患者与健康捐献者circRNA的丰度差异。在变化倍数≥2.0且P<0.05的条件下筛选出显著差异表达的circRNA。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞转染及分组取SRA01-04细胞进行培养，当SRA01-04细胞生长至细胞融合度达80%时，用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂将miR-control无序序列、miR-34a-5p mimics转染至SRA01-04细胞中，转染48 h后，收集所有细胞进行后续检测。后期实验为了进一步探讨HMGB1的作用，通过转染HMGB1过表达质粒pcDNA3.1-HMGB1构建 HMGB1过表达细胞株，并将转染相应阴性空载体 pcDNA3．1-control的细胞作为阴性对照。将体外培养的SRA01-04细胞随机分组，其中，空白对照组：用正常培养液培养，不作特殊处理；miR-control组：转染miR-control无序序列；miR-34a组：转染miR-34a-5p mimics序列；miR-34a+control组：共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空载体；miR-34a+HMGB1组：共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1质粒。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测使用Trizol法提取总RNA，并用SuperScriptII试剂盒合成cDNA。使用 qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，并以U6或GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCt法计算circRNA和miRNA的相对表达量。miR-34a上游引物序列为5’-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3’，下游引物序列为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；circKMT2E上游引物序列为5’-TCAGAGGAGCAGATTGCAGA-3’，下游引物序列为5’-CGCATAGGGCAAACCAAT-3’；GAPDH上游引物序列为5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3’，下游引物序列为5’-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3’。

1.3.3 双荧光素酶报告基因检测circKMT2E与miR-34a-5p相互作用当SRA01-04细胞在24孔板中生长至细胞融合度达80%时，使用miR-34a-5p mimic、miR空白对照(100 nmol·L-1)与报告(circKMT2E野生型序列或突变型序列)质粒(100 ng)与LipofectamineTM2000脂质体转染试剂共转染。转染48 h后，使用双荧光素酶试剂盒测量荧光素酶活性。

1.3.4 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况将SRA01-04细胞用胰蛋白酶消化、洗涤并用100 mL结合缓冲液重悬，使细胞最终密度为1×109个·L-1。然后将细胞用5 μL的Annexin V/FITC染色，上机检测前15 min加入1 μL PI染液。通过FACSCalibur流式细胞仪检测出细胞凋亡率。

1.3.5 Western blot检测各组细胞中Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白表达使用RIPA裂解缓冲液从SRA01-04细胞提取总蛋白。通过BCA蛋白质测定试剂盒检测样本蛋白浓度。将总蛋白样本进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜。用牛奶封闭4 h后，将PVDF膜与一抗(11000稀释)4 ℃过夜孵育。次日更换为二抗常温孵育2 h。使用ECL发光液进行显影，并定量蛋白条带。

1.4 统计学分析本研究采用SPSS 21.0软件包进行数据分析。数据以均数±标准差表示，采用方差分析和两独立样本t检验进行组间比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 circRNA芯片分析结果基于Illumina HiSeq4000平台的RNA-Seq共产生大约1亿个reads，随后将这些读数利用STAR软件依据人类参考基因组(UCSC hg19)进行注释。在所有样本中共识别到21 684个候选circRNA(reads≥1)，包括ARC患者中的17 241个和健康捐献者中的15 483个。高通量测序结果显示，ARC患者晶状体前囊膜组织中与健康捐献者相比，有397个显著差异表达的circRNA，其中249个表达下调，148个表达上调。经生物信息学分析显示，circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜组织中表达上调最为显著。

2.2 circKMT2E和miR-34a-5p表达的关系ARC患者晶状体前囊膜组织中circKMT2E与miR-34a-5p相对表达量呈负相关关系(r=-0.897，P=0.032)。

2.3 circKMT2E与miR-34a-5p的靶向结合关系经双荧光素酶报告基因实验证实，miR-34a-5p可与circKMT2E相互结合(图1)。双荧光素酶报告基因检测结果显示，转染miR-34a-5p后circKMT2E-WT报告基因的荧光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057，差异有统计学意义(t=22.921，P<0.05)；而circKMT2E-MUT报告基因的荧光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053，差异则无统计学意义(t=0.809，P>0.05)。

图1 circKMT2E和miR-34a-5p靶向结合序列

2.4 各组SRA01-04细胞凋亡情况miR-control组SRA01-04细胞凋亡率为3.82%±0.41%，空白对照组为3.56%±0.54%，两组相比差异无统计学意义(t=1.085，P>0.05)；但是miR-34a组SRA01-04细胞凋亡率(23.59%±3.47%)较miR-control组增高(t=16.001，P<0.05)。此外，miR-34a组和miR-34a-control组(24.59%±4.33%)SRA01-04细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(t=0.510，P>0.05)；而miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞凋亡率(8.97%±1.20%)较miR-34a-control组降低(t=10.319，P<0.05)(图2)。

2.5 各组SRA01-04细胞凋亡相关蛋白表达miR-control组与空白对照组相比，SRA01-04细胞Cyt-C蛋白(0.95±0.11、1.00±0.09)、Bax蛋白(1.05±0.04、1.00±0.06)和Bcl-2蛋白(0.98±0.03、1.00±0.05)相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。但是，miR-34a组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相对表达量较miR-control组分别增加至1.78±0.15和2.33±0.17(均为P<0.05)，同时Bcl-2蛋白相对表达量则降低至0.43±0.02(P<0.05)。miR-34a组和miR-34a-control组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白(1.78±0.15、1.83±0.23)、Bax蛋白(2.33±0.17、2.31±0.23)和Bcl-2蛋白(0.43±0.02、0.47±0.03)相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)；而与miR-34a-control组相比，miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相对表达量分别降低至0.80±0.03和0.93±0.05，同时Bcl-2蛋白相对表达量增加至1.56±0.11(均为P<0.05)(图3)。

A：空白对照组；B：miR-control组；C：miR-34a组；D：miR-34a+control组；E：miR-34a+HMGB1组。图2 流式细胞仪检测各组SAR01-04细胞凋亡情况

A：空白对照组；B：miR-control组；C：miR-34a组；D：miR-34a+control组；E：miR-34a+HMGB1组。图3 各组SRA01-04细胞凋亡相关蛋白表达情况

3 讨论

近年来，circRNA、miRNA和mRNA在疾病发生发展过程中的作用逐渐被人们所关注。与线性RNA不同，circRNA可以形成共价闭环结构，具有更高的稳定性和遗传保守性。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，circRNA在白内障发病机制中的作用逐渐被人们认识[5-6]。本研究通过高通量筛选发现，circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜中的表达上调，约为正常组织的2倍。因此，我们从circKMT2E出发，通过结合位点预测、双荧光素酶报告基因检测与实时荧光定量PCR验证，证实了circKMT2E对miR-34a-5p的海绵吸附作用。

ARC是目前最常见的眼部疾病之一，在ARC的发病机制中，晶状体上皮细胞对于维持整个晶状体的代谢稳定性和透明度至关重要，而其凋亡是白内障形成的主要细胞学基础。既往研究发现，miR-34a可通过多种途径促进晶状体上皮细胞凋亡，这可能与其靶向调控E2F转录因子3[7]、Sirtuin1[8]等下游蛋白表达有关。此外，Li等[9]研究发现，miR-34a通过下调Bcl-2表达促进晶状体上皮细胞凋亡；Fan等[10]研究也证实，miR-34a可靶向促进由晶状体上皮细胞线粒体功能障碍诱导的凋亡。这些研究结果均说明miR-34a-5p在晶状体和视网膜相关疾病中具有凋亡启动因子的作用。本研究中，我们通过检测各组细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达情况证实，上调miR-34a-5p表达确实可促进SRA01-04细胞凋亡。除此以外，我们还发现，miR-34a-5p可与HMGB1的3’-UTR直接结合并调控HMGB1的表达。

HMGB1最初被描述为核DNA结合蛋白，其在进化上具有高度保守性，在转录调控中起到核辅助因子的作用。和许多其他核辅助因子一样，HMGB1还可作为细胞间信使分子，从各种细胞释放到细胞外环境中，作用于特定的细胞表面受体，从而发挥促炎或促趋化和免疫调节作用[11]。但目前尚缺乏有关miR-34a与HMGB1在白内障的发病机制中的研究。我们猜测,circKMT2E可通过对miR-34a-5p的海绵吸附作用借助HMGB1抑制晶状体上皮细胞凋亡。本研究结果显示，在晶状体上皮细胞中过表达miR-34a-5p可显著增加晶状体上皮细胞凋亡率以及增高凋亡相关蛋白的表达水平，且降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达。而上调HMGB1表达后，上述miR-34a-5p的调控作用则被逆转。本研究结果与Li等[9]的研究结果相一致，同时对miR-34a-5p的上游作用机制进行了补充，丰富了人们对miR-34a促晶状体上皮细胞凋亡调控网络的认识。

综上所述，本研究证实了circKMT2E可通过海绵吸附miR-34a-5p减弱其对下游靶点HMGB1的抑制作用，进而有效地阻止SRA01-04细胞凋亡，在一定程度上起到延缓ARC发展的作用。因此，circKMT2E/miR-34a-5p/HMGB1通路有望成为ARC预防和治疗的潜在靶点。