C型凝集素样受体2与急性脑梗死病情程度及脑动脉狭窄的相关性研究

陈歌迪， 陶中海， 伏 兵， 谭 玉， 聂红霞， 周 芳， 张照婷， 于善花， 曾庆宏

急性脑梗死目前是我国中老年人死亡和致残的主要原因，降低人们的生存及生活质量[1]。而脑动脉粥样硬化性狭窄是引起急性脑梗死的主要病因[2]，较早期识别血管狭窄及准确判断患者的病情程度并采取针对性的治疗措施，是改善预后的关键。为了评估发生急性脑血管事件患者的神经功能缺损程度，临床上采用NIHSS量表[3],但存在评分偏向左侧大脑半球等局限。CLEC-2作为血小板膜受体，与相应配体结合后，在血小板的活化与聚集[4]、激活炎症反应等方面参与血栓形成[5～7]。有研究表明CLEC-2与缺血性疾病相关，而CLEC-2与急性脑梗死病情程度及脑动脉狭窄研究鲜有报道。对此我们进行了一项前瞻性研究，试图阐明其相关性。

1 对象和方法

1.1 研究对象 前瞻性选取2020年6月-2021年7月在连云港市第二人民医院神经内科首次发病住院的急性脑梗死患者，纳入标准：(1)发病时间在2 w之内；(2)符合中华医学会急性脑梗死诊断指南2010诊断标准；(3)经MRI明确诊断；(4)临床资料完整。排除标准：(1)既往口服过抗血小板及抗凝药物等；(2)既往有卒中病史者；(3)出血性卒中或心源性栓塞；(4)动静脉血管畸形、烟雾病、大动脉炎、动脉夹层分离、高凝状态、术后狭窄引起的缺血性卒中；(5)有明显感染或存在严重脏器功能不全、恶性肿瘤、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心功能不全者。该研究获得本院伦理委员会的审批，所有患者知情同意。并设同期本院105例健康体检者为对照组。

1.2 资料收集 详细记录所有患者以下资料：(1)年龄、性别、BMI指数等一般人口学资料；(2)吸烟、饮酒史；(3)既往糖尿病、高血压病病史；(4)入院收缩压、舒张压；(5)实验室检查：血糖(随机、空腹)、糖化血红蛋白、高同型半胱氨酸血症、甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、纤维蛋白原、尿酸；(6)临床资料：NIHSS评分。

1.3 分组方法 根据入院时NIHSS评分评估病情，并分为3个亚组：轻度组NIHSS<6分，中度组6分≤NIHSS≤13分，重度组NIHSS≥14分。每位患者均行MRA检查，由2位以上经验丰富的医师判断MRA结果后分为，脑动脉狭窄组：MRA显示管腔节段性变细甚至缺失(见图1)；无脑动脉狭窄组：为血管腔光滑，直径均匀一致(见图2)。

图1 右侧颈内动脉闭塞

图2 无脑动脉狭窄

1.4 血浆CLEC-2的测定 入组患者入院当天采集静脉血2～5 ml收集在含有柠檬酸钠作为抗凝剂的试管中，并以3000 rpm离心10 min后，将上清液存放于EP管中，统一保存到-80 ℃冰箱中，血浆标本于同一批次送检,采用 ELISA双抗体夹心法按照操作说明测定CLEC-2浓度，并对血浆CLEC-2浓度进行一式两份定量检测。

2 结 果

2.1 血浆CLEC-2水平与急性脑梗死病情严重程度的关系 共纳入急性脑梗死患者211例，其中男131例(62.1%)，女80例(38.4%)，年龄(61.23±11.38)岁，血浆CLEC-2水平为(269.340±68.551)pg/ml，同期健康对照组105人，男62例(59.1%)，女43例(40.9%)，年龄(58.75±7.97)岁，CLEC-2水平为(172.980±21.012)pg/ml，前者CLEC-2水平明显高于后者，差异有统计学意义(P<0.001)。按照入院时NIHSS评分把患者分为轻(128例，60.7%)、中(55例，26.1%)、重(28例，13.3%)3个亚组，CLEC-2水平分为(226.55±48.51)pg/ml、(323.23±28.72)pg/ml、(359.09±29.75)pg/ml，CLEC-2水平逐渐升高且3组之间两两比较，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2 脑动脉狭窄与无脑动脉狭窄两亚组间基线资料比较 梗死组患者根据MRA结果分为脑动脉狭窄组(122例，57.820%)和无脑动脉狭窄组(89例，42.180%)。单变量分析显示，脑动脉狭窄组年龄、BMI、吸烟史、入院收缩压、入院血糖(随机、空腹)、糖化血红蛋白、低密度脂蛋白、纤维蛋白原、高半胱氨酸、入院NIHSS评分和CLEC-2浓度与非狭窄组存在显著性差异(P<0.05)，可能为急性脑梗死患者合并脑动脉狭窄的危险因素(见表1)。

表1 狭窄组与无狭窄组危险因素的单变量分析

2.3 急性脑梗死患者脑动脉狭窄的多因素Logistic回归分析结果 以存在脑动脉狭窄为应变量，上述各项危险因素为自变量进行的多因素Logistic回归分析显示，年龄(OR=1.078，95%CI1.032～1.126，P=0.001)、BMI(OR=1.453,95%CI1.122～1.881,P=0.005)、纤维蛋白原(OR=2.159，95%CI1.191～3.915，P=0.011)、CLEC-2浓度(OR=1.034，95%CI1.020～1.048，P<0.001)为ACI患者存在脑动脉狭窄的独立危险因素。

2.4 CLEC-2预测急性脑梗死患者脑动脉狭窄ROC曲线分析结果 ROC曲线分析结果显示，CLEC-2浓度预测急性脑梗死患者脑动脉狭窄的曲线下面积为0.862(95%CI0.812～0.912，P<0.001)；最佳截断值为266.40 pg/ml，预测急性脑梗死患者脑动脉狭窄的敏感度为80.3%，特异度为80.9%(见图3)。

图3 入院时CLEC-2浓度预测急性脑梗死患者脑动脉狭窄的 受试者工作曲线

3 讨 论

急性脑梗死为神经内科最常见的脑血管疾病，发病率正逐年增长。能早期准确判断患者的病情程度并预测有无脑动脉狭窄，有效识别高危患者，并由此采取针对性的治疗，将会使患者大大获益。

CLEC-2为血小板Ⅱ型跨膜受体，属于C型凝集素超家族的一员，包括跨膜区和胞质尾区，胞质尾区的YXXL结构对于信号转导至关重要[8]。CLEC-2与内源性配体平足蛋白(podoplanin,PDPN)结合后可使酪氨酸激酶磷酸化，并激活磷脂酶γ2(PLCγ2)，最终使血小板聚集[9,10]。越来越多的研究报道了CLEC-2与血栓形成的密切相关，并维持血小板聚集体的稳定。Payne等使用下腔静脉狭窄的小鼠模型进行实验，人为补充缺失的CLEC-2后，引起血小板聚集，PDPN随之表达增加，而应用抗PDPN抗体可使血栓减小，提示CLEC-2和PDPN的表达及相互作用引起血栓形成[11]。临床研究发现，CLEC-2可在一定程度上反应血小板活化。费敏等人研究指出，血浆高CLEC-2水平是冠心病独立危险因素[12]。张伟等研究报道，高CLEC-2水平较低CLEC-2水平发生卒中进展及不良预后的风险为7.69、4.58倍[13]。

本研究首次探讨了CLEC-2与急性脑梗死早期神经功能缺损程度的相关性，表明血浆CLEC-2水平与急性脑梗死病情程度相关。当各种原因所致血管内皮损伤时，血小板被激活，引起血栓形成、管腔狭窄。如果脑组织缺血缺氧未及时得到改善，出现不可逆损伤，此时CLEC-2水平进一步增加，血小板活化及聚集反应会更加强化，可能导致脑动脉粥样硬化进展及和持续的血栓栓塞症状，脑组织损伤进一步加重[14]。此外，CLEC-2还可以和单核细胞PDPN可以诱导炎症反应，并通过调控巨噬细胞功能促使动脉粥样硬化。另外一项研究发现，经过PDPN抗体处理后的大脑中动脉闭塞的小鼠，IL-18和IL-1β显著降低，脑梗死的体积缩小，并改善神经缺损的症状，表明CLEC-2/PDPN轴通过促进炎症反应在小鼠脑缺血性损伤中发挥着重要作用[5]，以上为CLEC-2与急性脑梗死病情程度相关的病理生理学机制。

脑动脉狭窄发生的主要病理生理过程就是动脉粥样硬化及血栓的形成，是急性脑梗死的重要病因和明确的危险因素[15,16]，既往细胞及动物研究发现CLEC-2与动脉粥样硬化密切相关，动物模型研究发现在晚期动脉粥样硬化病变中发现了CLEC-2的配体PDPN，当动脉粥样硬化的进展时，PDPN浓度增加，并进一步加重损伤[17]。而在早期的动脉粥样病变，血管内皮损伤导致平滑肌细胞表达S100A13，引发血小板聚集，表明可能是独立于PDPN的另一个CLEC2的潜在配体，S100A13和podoplanin的不同定位可能与其作用不同有关[18]。此外Furukoji等也发现，当动脉粥样硬化发生时，平滑肌细胞和巨噬细胞和都可以表达血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)其诱导PDPN的过度表达并激活CLEC-2，导致血栓形成[19]。因此，本研究综合选择了脑梗死的常见危险因素并包括CLEC-2在内的多项生化指标，对梗死组脑动脉狭窄患者和无脑动脉狭窄患者进行比较，将有差异的变量纳入多因素Logistic回归分析后，表明脑动脉狭窄发生的独立危险因素分别是年龄、BMI、纤维蛋白原、CLEC-2浓度，且狭窄组的风险是无狭窄组的1.078、1.453、2.159、1.034倍，虽然研究显示糖尿病、低密度脂蛋白等分布差异不明显，可能与患者为初次发病，发病年龄低，较多人处于糖尿病前期，病变处于动脉硬化早期阶段，低密度脂蛋白较纤维蛋白原沉积并不显著[20]。ROC曲线提示，CLEC-2水平高于266.40 pg/ml可能有较高的风险发生脑动脉狭窄。以上结果表明，CLEC-2可能反映了动脉粥样硬化疾病中的血小板活化和斑块易损性，提示CLEC-2及其配体是血小板、免疫细胞和靶细胞之间的分子桥梁，是炎症和血栓形成之间的新型机制联系。

总之，本研究结果提示血浆CLEC-2升高可作为急性脑梗死病情程度及有无血管狭窄的评估，但具体机制仍需进一步研究。未来找到CLEC-2及其配体在疾病诊断、治疗和应用中的平衡具有十分重要的意义。本研究局限：(1)少量样本研究有一定的选择性偏倚；(2)我们只测定了入院时CLEC-2水平，不能揭示CLEC-2水平升高是脑血管疾病的结果还是致病因素,二者之间因果关系尚不能确定;(3)脑血管狭窄的危险因素并未完全纳入,且血浆CLEC-2升高与大动脉狭窄的独立关联机制尚不清楚，上述的不足之处均可能对结果产生影响，因此应谨慎看待本研究结果，未来需要更大样本、更加完善的设计方案来进一步证实。