普通油茶总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性比较

谷睿 邹蓉 唐健民 朱成豪 宁莞权 曹其义

摘要：为测定5种山茶科植物（普通油茶、博白大果油茶、宛田红花油茶、金花茶、大果石笔木）叶片总黄酮含量，并比较其黄酮对·OH、DPPH·和O-2·的清除作用和总还原力。通过优化超声波萃取普通油茶叶总黄酮工艺，在单因素试验基础上结合响应面优化分析，确定最佳提取条件为超声波低频（35 kHz）、超声功率452.4 W、乙醇体积分数40%、料液比1 g ∶51.5 mL、提取温度63.5 ℃、提取时间37.2 min，在该最佳条件下测得的博白大果油茶总黄酮得率最高（8.67%），其次是宛田红花油茶（6.97%）、普通油茶（4.96%）、金花茶（1.64%）、大果石笔木（0.48%）。抗氧化活性比较结果表明，普通油茶、博白大果油茶、宛田红花油茶都具有明显较好的抗氧化活性。因此，这3种植物叶片都适宜作为黄酮提取的工业原料，其中普通油茶更易获取，最适合作为抗氧化保健茶叶产品的原料。

关键词：普通油茶;响应面优化;总黄酮;提取工艺;抗氧化活性

中图分类号：R284 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）04-0163-07

收稿日期：2021-05-01

基金项目：广西自然科学基金（编号：2020GXNSFAA259029、2017GXNSFBA198011）;中央引导地方科技发展专项基金（编号：桂科ZY1949013）;广西科技基础和人才专项（编号：桂科AD17129022）;广西植物功能物质研究与利用重点实验室（编号：ZRJJ2018-9）;广西植物研究所基本业务费（编号：桂植业18013、桂植业18014、桂植业19002）。

作者简介：谷 睿（1993—），男，安徽马鞍山人，硕士研究生，主要从事药用植物景观应用研究。E-mail：593763134@qq.com。

通信作者：唐健民，硕士，助理研究员，主要从事药用植物学和保护生物学研究。E-mail：1499494130@qq.com。

黄酮是一种强抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，其抗氧化能力是维生素E的10倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，阻止癌症的发生，同时还具有提高免疫力、降血脂、降血压等功效。目前，市面上生物类黄酮加工而成的食品以茶叶、蜂胶、银杏、山楂、沙棘、荞麦、柑桔皮等加工品最多[1]。茶叶作为一种国际性饮料，富含多种黄酮类化合物，具有很高的经济价值，早已成为我国国际贸易的重要商品，但目前山茶科植物叶中的黄酮资源利用较少。如油茶以采果实为主，叶片往往任其自然凋落，在油茶的整形修剪、低产油茶林的改造过程中，大量的油茶叶常被作为废弃物而丢弃，极大地浪费了资源[2-3]。因此，笔者于2019年7—9月在广西植物研究所植物保育生物学研究组实验室开展普通油茶（Camellia oleifera）总黄酮提取工艺优化研究，并与其他4种山茶科植物山茶属博白大果油茶（Camellia gigantocarpa Hu et Huang）、宛田红花油茶（Camellia polyodonta How ex Hu）、金花茶（Camellia nitidissima）以及石笔木属大果石笔木[Pyrenaria spectabilis（Charp.）C. Y. Wu & S.X.Yang]的黄酮含量和抗氧化活性进行比较，以更深入了解相关山茶科植物叶片中的黄酮含量及抗氧化能力，对黄酮资源进一步开发和利用具有一定的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料与试剂 试验材料为2019年7月采自广西植物研究所桂林植物园的普通油茶、博白大果油茶、宛田紅花油茶、金花茶和大果石笔木鲜叶，挑选无病无虫害的完整叶片进行清洗，置于 55 ℃ 烘箱烘干后粉碎过60目筛备用。芸香苷标准品（批号：MUST-12040302），由中国食品药品检定研究所提供;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯，均购自桂林卓一生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司;DL-720E智能超声波、电子分析天平（AE200S型，精度为0.1 mg），均购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线制作 精确称取真空干燥至恒质量的芸香苷标准品20 mg，用乙醇溶解制成 0.4 mg/mL 的对照品溶液。分别取制备好的对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于 25 mL 容量瓶中。加10 mL 50%乙醇，加1 mL 5%亚硝酸钠，混匀，静置6 min;加1 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，静置6 min;加10 mL 4%氢氧化钠溶液，用50%乙醇调至刻度，混匀，得空白液、对照品溶液;静置15 min后在190～900 nm处进行光谱扫描，确定选用510 nm作为测定波长[4]。

以吸光度为纵坐标（Y）、总黄酮浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，获得回归方程为Y=12.623X+0.003，r2=0.999 2，总黄酮浓度在0.001 6～0.0160 mg/mL 范围内，线性关系良好。

1.2.2 供试品单因素试验 称取各植物叶样品粉末0.5 g，按照一定料液比（1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL、1 g ∶60 mL）加入一定体积分数（20%、40%、60%、80%、100%）的乙醇。采用超声波辅助提取法，以高频（61 kHz）或低频（35 kHz）设置一定功率（60、180、300、420、540 W），在一定温度（40、50、60、70、80 ℃）下提取一定时间（10、30、50、70、90 min），收集滤液定容至50 mL备用。摇匀后取1 mL供试品溶液于25 mL容量瓶中，加入试剂的方法同“1.2.1”节中的步骤，最终得供试样品，静置15 min后同样选用510 nm作为测定波长进行光谱扫描。为提高结果的精准度，每个单因素制作5次重复，记录吸光度数据并计算制图[5-7]。

总黄酮得率的计算方法：得率=C×Vm×100%，式中：C为提取液中总黄酮的浓度，mg/mL;V为提取液体积，mL;m为样品粉末质量，mg。

1.2.3 响应面优化分析 采用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验[8]。根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，从单因素试验中选取对提取结果影响比较大的4个因素（料液比、超声功率、提取温度、提取时间）为自变量，总黄酮得率为响应值，共计29个试验组进行试验。因素与水平见表1。

1.2.4 总黄酮体外抗氧化活性试验 在响应面分析得到的最佳条件下获得这5种植物叶总黄酮提取液，再过滤于50 mL容量瓶中，加无水乙醇调至 50 mL 刻度线处，作为样液待用。参照朱成豪等的方法[5-6，9-10]，结合自己的试验略作调整，进行总黄酮对·OH、DPPH·、O-2·的清除测定试验。

1.2.4.1 总黄酮对·OH的清除测定试验 试管中加入1 mL 0.75 mol/L邻二氮菲，2 mL pH值为7.45的磷酸盐缓冲（PBS）溶液，1 mL蒸馏水，1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 0.01% H2O2，充分混匀后于 37 ℃ 条件下恒温水浴1 h。在536 nm处测定其吸光度（D0）;用1 mL水代替H2O2，并测定其吸光度（D1）;分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL样液，用蒸馏水调到 1 mL，得到的不同浓度的样液代替1 mL水，测定其吸光度（D2）。每组试验重复3次，取平均值。以维生素C作对照。

·OH清除率=（D2-D0）/（D1-D0）×100%。

1.2.4.2 总黄酮对DPPH·的清除测定试验 用无水乙醇配制0.04 mg/mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH溶液，分别取不同植物样液2 mL，加入2 mL DPPH溶液，混匀后在室温暗处避光反应 30 min，在517 nm处测定其吸光度（D1）。分别取不同植物样液2 mL，加入2 mL无水乙醇，同样在 517 nm 处测定其吸光度（D2）;2 mL的DPPH溶液与2 mL无水乙醇等体积混合液的吸光度为D0。每组试验重复3次，取平均值。以维生素C作对照。

DPPH·清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%。

1.2.4.3 总黄酮对O-2·的清除测定试验

取 5 mL 0.05 mol/L pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液，在25 ℃水浴预热20 min，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL样液与蒸馏水混合得到1 mL不同浓度的样液，加入0.5 mL 25 mmol/L邻苯三酚，混匀后在 25 ℃ 水浴准确反应4 min，立即加入2滴8 mol/L HCl终止反应。在299 nm处测定吸光度（D1），用 1 mL 样液代替样液作为对照组的吸光度（D0）。将邻苯三酚溶液用0.5 mL蒸馏水代替，得到吸光度（D2）。每组试验重复3次，取平均值。以维生素C作对照。

O-2·清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%。

1.2.4.4 总黄酮对总还原力的测定试验 分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL样液，用蒸馏水调到 1 mL。加入2.5 mL 1%铁氰化钾溶液和2.5 mL 0.22 mol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀后于50 ℃水浴中反应30 min，迅速冷却加入2.5 mL 10%三氯乙酸，在4 000 r/min下离心10 min。最后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸馏水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混匀后静置10 min，在700 nm处测定吸光度。以维生素C作对照。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 超声波频率对普通油茶总黄酮得率的影响 以超声频率[高频（61 kHz）和低频（35 kHz）]为变量，1 g ∶20 mL 料液比、乙醇体积分数为50%、180 W超声功率、40 ℃提取温度、30 min提取时间为定量，通过测定提取液供试品的吸光度并计算总黄酮得率。如图1所示，低频（35 kHz）条件下总黄酮得率明显优于高频（61 kHz），达到4.26%。

2.1.2 料液比对普通油茶总黄酮得率的影响 以料液比[1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL、1 g ∶60 mL]为变量，超声低频（35 kHz）、乙醇体积分数为50%、180 W超声功率、40 ℃提取温度、30 min 提取时间为定量，通过测定提取液供试品的吸光度并计算总黄酮得率。如图2所示，料液比在 1 g ∶50 mL 时，总黄酮得率最高，达到5.24%。

2.1.3 乙醇体积分数对普通油茶总黄酮得率的影响 以乙醇体积分数（20%、40%、60%、80%、100%）为变量，超声低频（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、180 W 超声功率、40 ℃提取温度、30 min提取时间为定量，通过测定提取液供试品的吸光度并计算总黄酮得率。如图3所示，乙醇体积分数在40%时，总黄酮得率最高，达到4.57%。

2.1.4 超声波功率对普通油茶总黄酮得率的影响 以超声功率（60、180、300、420、540 W）为变量，超声低频（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、乙醇体积分数为50%、40 ℃提取温度、30 min提取时间为定量，通过测定提取液供试品的吸光度并计算总黄酮得率。如图4所示，超声功率在420 W时，总黄酮得率最高，达到4.03%。

2.1.5 提取温度对普通油茶总黄酮得率的影响 以提取温度（40、50、60、70、80 ℃）为变量，超声低频（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、180 W超声功率、乙醇体积分数为50%、30 min提取时间为定量，通过测定提取液供试品的吸光度并计算总黄酮得率。如图5所示，提取温度在60 ℃时，总黄酮得率最高，达到4.50%。

2.1.6 提取时间对普通油茶总黄酮得率的影响 以提取时间（10、30、50、70、90 min）为变量，超声低频（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、180 W超声功率、乙醇体积分数为50%、40 ℃提取温度为定量，通过测定提取液供试品的吸光度并计算总黄酮得率。如图6所示，提取时间在30 min时，总黄酮得率最高，达到4.63%。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据表 2设定的水平和因素，共设29个试验点，其中 24个为析因点，5个为零点。得到各个试验条件的总黄酮得率，试验结果见表2。

2.2.2 回归模型的建立与分析 采用Design Expert 8.0.6 软件对表2中试验数据进行多项拟合回归，得到普通油茶叶片总黄酮得率（Y）对料液比（A）、超声功率（B）、提取温度（C）、提取时间（D）的二次多项回归模型方程为Y=4.770 0+0.061 0A+0.120 0B+0.310 0C+0.220 0D-0.037 0AB+0.120 0AC-0.057 0AD-0.078 0BC+0.002 4BD-0.049 0CD-0.240 0A2-0.160 0B2-0.410 0C2-0.260 0D2，式中：Y为普通油茶叶片总黄酮得率的预测值。

从表3可以看出，失拟误差不显著;该回归模型的P<0.000 1，说明本试验所采用的二次模型是极显著的。料液比、超声功率、提取温度、提取时间的单项、二次项及交互项AC都对油茶叶片黄酮得率有极显著影响;预测复相关系数R2为0.98 4，调整系数R2Adj为0.968，也表明试验的实际值和预测值拟合度比较好。说明该模型能解释96.8%响应值的变化，即该模型与实际试验拟合程度良好，试验误差小，用该模型分析和预测油茶叶片黄酮的提取是合适的[9]。

2.2.3 响应面交互作用分析 通过采用Design Expert 8.0.6软件，将AB、AC、AD、BC、BD、CD交互进行分析比较，做出响应面曲面图（图7）。由这6组响应面曲面图可知，当各因素的水平从-1至1增大过程，先是在一定范围内对应的响应值不断增大;然后响应值达到最高点，再随着各因素的值继续增大，其响应值不断减小。高线图的中心点在3D图上的投影即最高点，表明该点的提取率最高。这6组图都反映出每个响应曲面呈现开口向下的凸面形状。

2.2.4 优化与验证试验 依据以上响应面试验模型和结果分析，料液比为1 g ∶51.5 mL，超声功率为452.4 W，提取温度为63.5 ℃，提取时间为 37.2 min 时为最佳条件，在最佳提取条件下普通油茶叶中总黄酮的提取率为4.88%。在此最佳条件下，将平行验证试验重复进行5次，可得普通油茶叶片总黄酮的提取率平均值为4.96%。实际所测得的提取率的平均值比预测值增加0.076%，表明预测模型的可靠性较高。

2.3 5种山茶科植物叶片的总黄酮得率比较

在以上最佳提取条件下，对普通油茶、博白大果油茶、宛田红花油茶、金花茶、大果石笔木等5种植物叶片的总黄酮得率进行比较。结果（图8）表明，同一条件下博白大果油茶叶片总黄酮的得率（8.67%）最高，是最低的大果石笔木得率（0.48%）的18倍，其次较高的是宛田红花油茶（6.97%）和普通油茶（4.96%），金花茶（1.64%）较低。

2.4 体外抗氧化活性试验结果与分析

2.4.1 总黄酮对·OH的清除作用 由图9可知，随着加入植物样液或维生素C溶液体积的增加，即浓度越大，对·OH的清除率不断增强。不同浓度下，博白大果油茶和宛田红花油茶对·OH的清除率都大于维生素C。在加入样液为1.0 mL时，清除率表现为博白大果油茶>普通油茶>宛田红花油茶>维生素C>金花茶>大果石笔木。

2.4.2 总黄酮对DPPH·的清除作用 由图10可知，在同体积（2 mL）样液下，这5种植物样液黄酮对DPPH·的清除率都低于维生素C。清除率表现为维生素C>博白大果油茶>宛田红花油茶>金花茶>普通油茶>大果石笔木。

2.4.3 总黄酮对O-2·的清除作用 由图11可知，随着加入样液或加入维生素C溶液体积的不断增加，即浓度越大，对O-2·的清除率也不断增强。普通油茶样液对O-2·的清除率明显高于维生素C，而且，随样液体积增加普通油茶对O-2·的清除率明显提高。当体积为1.0 mL时，普通油茶的清除率可达到88.4%，对O-2·的清除作用表现为普通油茶>维生素C>博白大果油茶>宛田红花油茶>金花茶>大果石笔木。

2.4.4 总还原力的测定 由图12可知，随着加入样液或维生素C液体积的不断增加，即浓度越大，总还原力不断增强。在样液体积达到1.0 mL时，总还原力表现为普通油茶>宛田红花油茶>博白大果油茶>维生素C>金花茶>大果石笔木。

3 结论

超声波辅助提取茶叶中的总黄酮与传统的醇提法相比具有明显优势。一方面可以通过空化作用破坏茶叶细胞明显提高总黄酮得率，另一方面可以在室温下进行，方法简单易行，所用时间周期短，利于工业化生产。本研究采用超声波辅助提取普通油茶总黄酮，并通过响应面法优化提取工艺，获得的最优提取工艺条件为超声波低频（35 kHz），乙醇体积分数为40%，料液比为1 g ∶51.5 mL，超声功率为452.4 W，提取温度为63.5 ℃，提取时间为37.2 min，普通油茶总黄酮得率预测值为4.88%。在最佳提取条件下测定5种山茶科植物叶片总黄酮得率，并比较得出：博白大果油茶（8.67%）>宛田红花油茶（6.97%）>普通油茶（4.96%）>金花茶（1.64%）>大果石笔木（0.48%）。植物体外抗氧化活性试验结果表明，随加入样液体积增加，不同植物对·OH、DPPH·和O-2·的清除率和总还原力都明显增强。在加入同体积1 mL样液时，博白大果油茶、普通油茶和宛田红花油茶对·OH的清除作用都优于维生素C;普通油茶对O-2·的清除作用效果最好;普通油茶、宛田红花油茶和博白大果油茶的总还原力都强于维生素C。在同体积（2 mL）样液时，5种植物对DPPH·的清除率都不及维生素C，但博白大果油茶、宛田红花油茶以及金花茶的清除率也都达到90%以上。

本研究通过测定并比较5种山茶科植物叶片总黄酮得率以及体外抗氧化活性，发现普通油茶、博白大果油茶以及宛田红花油茶的总黄酮得率都较高，且抗氧化活性也都明显较好，这3种植物叶片都较适合作为黄酮提取的工业原料。由于普通油茶在野外资源更丰富，在规模化种植上也更常见，因此普通油茶比博白大果油茶和宛田红花油茶更适合作为生产具有抗氧化保健茶产品的原料。

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