饲粮添加发酵枣粉对高温季节荷斯坦公牛生长性能、免疫性能和抗氧化性能的影响

张喆萍 李瑞银 李树静 李建国 沈宜钊 高艳霞 李 妍 范京惠 谢 鹏 李秋凤* 曹玉凤*

(1.河北农业大学动物科技学院，保定071000；2.河北天和肉牛养殖有限公司，石家庄050200；3.河北农业大学动物医学院，保定071000；4.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100081)

4～9月龄是荷斯坦奶公牛由采食颗粒饲料过渡到全混合日粮的阶段，此阶段奶公犊的消化系统、免疫系统等尚未发育成熟[1]，容易受养殖过程中环境、饲料、疾病等因素引起机体的氧化应激损伤。在众多氧化应激源中，高温环境造成的热应激是最普遍且难以避免的，高温季节下机体各种生理指标、身体机能、行为等指标将发生一系列的变化，进而直接影响动物的健康和生产性能[2]。机体最终能否克服应激源造成的危害，取决于刺激的强度与机体自身的生理状况[3]。因此，为确保荷斯坦公牛适宜的生长速度，保证其后续的生产性能，这就要求为这一阶段的荷斯坦公牛提供易吸收、能够提高免疫力、营养均衡的饲粮[4-5]。

我国近年来大力开展饲料资源开发与利用研究，其中枣粉味道香甜，能增加饲料适口性，提高采食量，枣中富含的红枣多糖、酚类、皂苷、三萜类化合物、环磷酸腺苷等活性成分更是天然的抗氧化剂[6]，特别是经过复合菌发酵的枣粉更加醇香，易吸收，其促生长、抗氧化、抗应激、提高免疫力的作用更佳[7]。饲粮中添加枣粉在反刍动物生产中应用研究较少，陈晓校[8]研究发现，在成年荷斯坦公牛的饲粮中添加10%枣粉能增强瘤胃液及血液总抗氧化能力(T-AOC)，提高粗蛋白质消化率和产奶量。冀建军等[9]在1岁杂交肉牛育肥试验中发现，用15%生物发酵枣粉替代玉米，其平均日增重(ADG)比对照组(无添加)提高了24.37%。枣粉在牛上应用研究主要集中在成年奶牛以及肉牛育肥阶段，而发酵枣粉在高温季节对4～9月龄荷斯坦公牛的生长速度、行为、生长性能和血清生化指标等方面尚未研究。因此，本试验通过探究饲粮添加发酵枣粉对高温季节4～9月龄荷斯坦公牛的行为特征、生长性能、免疫性能和抗氧化性能的影响，为后期发酵枣粉对这一阶段奶公牛的健康状态影响和生产中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年7月至2019年10月在沧州市中特牧业有限公司进行。试验动物、饲粮、场地均由沧州市中特牧业提供支持。

1.2 试验动物与试验设计

本试验采用单因素随机试验设计，选择同一批次、健康、体型和体重[(200.00±30.28) kg]相近的60头4～6月龄左右荷斯坦公牛作为试验动物，随机分为4组，每组15头。4组荷斯坦公牛分别饲喂含0(C组)、5%(L组)、10%(M组)、15%(H组)发酵枣粉的饲粮，发酵枣粉是干枣经过粉碎后与其他优质谷物(玉米胚芽粕、豆粕等)混合后，每吨干料添加30%的水与菌液(2×1011CFU枯草芽孢杆菌、7×109CFU活酵母、2 g乳酸菌)后，密封袋贮，25 ℃发酵3 d，其中发酵枣粉蛋白质含量为14.98%，脂肪含量为1.5%，钙、磷含量分别为0.58%、0.21%，中性洗涤纤维(NDF)含量为45.82%，酸性洗涤纤维(ADF)含量为35.99%。4组饲粮粗蛋白质、综合净能水平一致，基础饲粮参考《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)配制，试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

续表1项目 ItemsC组 C groupL组 L groupM组 M groupH组 H group全株玉米青贮 Whole corn silage26.6226.6226.6226.62羊草 Chinese wildrye16.4816.4816.4816.48合计 Total100.00100.00100.00100.00营养水平 Nutrient levels2)综合净能 NEmf/(MJ/kg)5.445.445.445.44粗蛋白质 CP14.0014.0014.0014.00粗脂肪 EE2.372.372.382.39中性洗涤纤维 NDF 36.7736.9537.1337.31酸性洗涤纤维 ADF 20.5920.9321.2721.61酸性洗涤木质素 ADL 3.283.503.674.14钙 Ca 0.500.520.540.56磷 P 0.310.310.310.31

1.3 饲养管理

进圈前7 d，对圈舍进行消毒。预试期7 d，正试期91 d。每天于09:00饲喂1次，自由采食，自由饮水，每2 d清洗水槽，以保证水质清洁和充足。每天巡视牛圈，观察牛的采食与健康状态以便及时发现问题。

1.4 样品的采集

1.4.1 饲粮样、粪样采集

在试验结束前，连续采集3 d上、下午各组全混合日粮，将每天每组采集饲粮混合均匀，于65 ℃烘干，粉碎备用，以测定其营养成分。从各试验组中随机选择5头牛，连续3 d在06：00和16：00直肠采粪，每头牛每天收集粪样约600 g混匀(其中，300 g加50 mL 10%的硫酸用于固氮，测定粪中粗蛋白质含量；一半不加酸，待测其他常规营养成分含量)，采集的粪样放入烘箱65 ℃ 76 h，室温回潮24 h，粉碎备用。

1.4.2 血样的采集

分别在正试期第1、30、90天，采用颈静脉无菌采血法(使用促凝管和抗凝管),从每组选择5头牛在早晨饲喂前进行血样采集，血样于37 ℃水浴30 min后3 000 r/min离心15 min，将上清液分装到0.5 mL小离心管中，置于-20 ℃保存待测血清生化指标。

1.5 指标测定及计算

1.5.1 温湿指数(THI)

将温湿度表挂置距离地面1.5 m处，每个组分别挂1个。每天分别于08:00、14:00、18:00利用温湿度表记录温度、湿度，计算THI。最后利用Excel绘制出THI的折线图。

温热环境的评价采用国内外公认的表示热应激的THI，计算公式如下：

THI=(1.8×AT+32)-0.55-0.55×
RH/100)×(1.8×AT-26)。

式中：THI为温湿指数；AT为气温(℃)；RH为相对湿度(%)。

1.5.2 躺卧率和呼吸频率指标测定

每隔1 d在12:00—13：00，每隔15 min观察1次躺卧率，并记录躺卧的牛只数，计算躺卧率。在每组选取5头牛，观察并用秒表、记录每分钟的呼吸频率，每头牛观察3 min，记录呼吸频率。

1.5.3 生长性能指标测定

在试验期的第1天和第91天晨饲前，空腹称量体重，测量荷斯坦公牛的体高、体斜长、胸围。记录试验动物的初始体重和末重，以计算平均日增重和体高增长。每隔15 d进行1次干物质采食量(DMI)的测定。根据平均日增重和平均日采食量计算料重比(F/G)。

1.5.4 营养成分表观消化率测定

采集的饲粮样品、粪便样品参照张丽英[10]的常规分析方法进行营养成分含量测定，利用盐酸不溶灰分(AIA)作为指示剂，依据GB/T 23742—2009《饲料中盐酸不溶灰分的测定》测定AIA含量。计算各营养成分表观消化率。计算公式如下：

某营养成分表观消化率(%)=[(a/c-
b/d)/(a/c)]×100。

式中：a为饲粮中该营养成分含量；b为粪中该营养成分含量；c为饲粮中指示剂含量；d为粪中指示剂含量。

1.5.5 血清生化指标测定

血清葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)含量使用全自动生化分析仪(BS-420，深圳迈瑞)测定。总蛋白(TP)含量测定所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所，使用酶标仪DNM-9602进行测定。白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、热休克因子-1(HSF-1)、皮质醇(Cor)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、丙二醛(MAD)含量，T-AOC及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性由北京华悦昌生物科技有限公司使用酶标仪(MK3，芬兰雷勃)测定。

1.6 数据处理与分析

数据利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著用Duncan氏法进行组间多重比较。试验结果用平均值和标准误(SEM)表示，P<0.05为差异显著，0.050.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 试验期间牛舍THI变化

根据图1牛舍THI动态变化图，从7月15日到9月30日，THI一直处于75之上，直到10月份THI才低于75，说明7、8、9、10月份肉牛一直处于热应激状态，其中7月15日到8月底THI高于78，热应激最为严重，9月THI处于75～78。

图1 牛舍温热环境的动态变化

2.2 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛躺卧率与呼吸频率的影响

如表2所示，试验期间，当THI<72，与对照组相比，M组、H组呼吸频率显著低于C组(P<0.05)。当720.05)。当57

2.3 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛生长性能的影响

如表3所示，4组荷斯坦公牛初始体重和终末体重无显著差异(P>0.05)；随着发酵枣粉添加量的增加，平均日增重呈显著二次升高(P=0.008)。H组平均日增重显著降低(P<0.05)，显著提高料重比(P<0.01)；M组平均日增重达到最高，料重比降低不显著(P>0.05)。与C组、H组相比，L组、M组体高增长显著提高(P<0.05)。

表2 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛躺卧率和呼吸频率的影响

表3 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛生长性能的影响

2.4 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛饲粮营养成分表观消化率的影响

如表4所示，钙、磷、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、干物质的表观消化率4组之间均无显著差异(P>0.05)。M组粗蛋白质表观消化率显著高于其他组(P<0.05)。粗脂肪表观消化率随着发酵枣粉添加量增加呈线性增加(P<0.001)。

表4 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛营养成分表观消化率的影响

2.5 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛血清生化指标的影响

如表5所示，试验第1天，血清生化指标各组之间无显著差异(P>0.05)。试验第30天，H组血清T3的含量显著高于C组(P<0.05),与L组、M组无显著差异(P>0.05)；血清T3含量呈线性增加(P=0.017)；M组血清T4含量显著高于C组、L组(P<0.05)，与H组无显著差异(P>0.05)，血清T4含量呈线性增加(P=0.011)；M组血清TP含量显著高于C组(P<0.05)，且呈二次升高趋势(P=0.088)；血清UN含量呈二次下降变化(P=0.010)。试验第90天，各组血清T3含量无显著差异(P>0.05)；M组、H组血清HSF-1含量显著高于C组(P<0.05)；M组、H组血清Cor含量显著低于C组、L组(P<0.05)。

表5 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛血清生化指标的影响

2.6 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛血清免疫指标和抗氧化指标的影响

如表6所示，试验第1天，各组各血清免疫指标无显著差异(P>0.05)。试验第30天，M组血清IL-1含量显著降低(P<0.05)；与C组、H组相比，M组血清IL-6含量显著降低(P<0.05)，且呈显著二次降低(P<0.001)；H组血清IgA含量显著高于其他3组(P<0.05)；H组血清IgG含量显著高于C组(P<0.05)，与其他2组无显著差异(P>0.05)；试验第90天，M组和H组血清IL-1含量显著低于C组(P<0.05)；随着发酵枣粉添加量的增加，血清IgA含量呈线性升高(P=0.019)。试验第1天，各组血清中抗氧化酶活性无显著差异(P>0.05)；试验第31天，随着发酵枣粉添加量的增加，血清中T-AOC呈线性上升趋势(P=0.137)；试验第90天，M组血清T-AOC显著高于C组(P<0.05)。与C组比，添加发酵枣粉能够显著降低血清中MDA含量(P<0.05)。随着发酵枣粉添加量的增加，各组血清SOD活性呈线性升高趋势(P=0.023)。

表6 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛血清免疫指标和抗氧化指标的影响

3 讨 论

3.1 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛躺卧率和呼吸频率的影响

热应激会导致牛体热平衡、呼吸系统和消化系统的变化。廖晓霞等[11]指出，当奶牛处于轻度热应激时，呼吸频率为50～60次/min；中度热应激时呼吸频率为80～120次/min；严重热应激时，呼吸频率可达120～160次/min。本试验THI在78以上，荷斯坦公牛呼吸频率在80次/min以上，说明牛群处于中度热应激。热应激严重时，牛群会焦躁不安，站立踱步、躺卧率会降低。红枣中黄酮类，有镇定安神[12]、抗氧化应激的功效，本试验结果显示，当72

3.2 饲粮添加发酵枣粉对高温季节荷斯坦公牛生长性能的影响

高温季节动物为了维持机体热平衡通过降低采食量以减少食后体增热，导致营养物质摄入吸收减少，氧化损伤严重，从而降低生长性能。经发酵的枣粉味道香甜，能够提高适口性，提高采食量，改善微生物区系，提高饲料的利用率[13-14]，所富含的皂苷、多糖、膳食纤维、酮类活性成分是天然的抗氧化剂[13]，能提高机体抗氧化能力降低氧化损伤；冯平等[15]研究发现，枣粉能提高白绒山羊的瘤胃降解率和生长性能，其中添加15%、20%和25%组的干物质消化率、平均日采食量和平均日增重均显著高于对照组。本试验结果显示，添加10%发酵枣粉，平均日增重、体高增长均高于对照组，与吝常华等[14]研究结果相似，当发酵枣粉比例增加到15%时荷斯坦公牛的增重受阻。

有研究证明益生菌进入消化道后，能够通过调控肠道免疫反应，最终影响骨骼代谢活动，许多免疫因子参与调控成骨和破骨作用[16]。IL-1会降低骨保护素的形成，抑制骨形成，也可直接通过核因子-B受体活化因子配基(RANKL)影响破骨细胞的增殖分化成熟[17]。有研究表明，酸枣仁提取物能通过调控Gi/o蛋白表达从而抑制环磷酸腺苷-蛋白激酶(cAMP-PKA)通路实现的骨骼增长的作用[18]，酸枣仁提取物增加生长激素分泌[19]，促进身高增长。本试验中，试验第30天，饲喂5%、10%发酵枣粉能降低血清中IL-1的含量从而抑制破骨细胞，促进成骨细胞，促进体高增长，而当发酵枣粉添加量达到15%时，血清IL-1含量增加抑制骨形成，减慢体高增长，也是其平均日增重显著降低的原因之一。本试验选择4～6月龄公犊牛正处于骨骼生长最快的关键的阶段，而高温季节会减弱甲状腺功能，骨转化减慢，骨矿化周期延长[20]。本试验中，添加5%、10%发酵枣粉能够促进体尺增长，其中体高增长显著高于对照组，然而15%组的体高增长会受到抑制，可能是饲粮中添加高剂量发酵枣粉，造成瘤胃中乳酸菌大量增殖，而高水平乳酸菌(≥106CFU/mL)能抑制细胞生长和阻滞细胞周期[21]，造成体高增长抑制，进一步抑制犊牛平均日增重。可见发酵枣粉的添加量尤为重要，添加10%发酵枣粉可以缓解热应激对荷斯坦公牛体尺生长的不良影响。

3.3 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛饲粮营养成分表观消化率的影响

动物机体处于高温环境中大量血液被分配到体表以增加散热导致消化道血流量减少，机体长时间缺血、缺氧,胃肠黏膜上皮细胞的结构和功能都会受到严重损害[22-24]，饮水量增加会稀释瘤胃内容物，瘤胃菌群活动减少[25]，导致营养成分表观消化率降低。姜义宝等[26]研究表明，黄酮类化合物可提高糖、脂肪和蛋白质的代谢，促进营养物质的相互转化。黑沙蒿及其多糖可通过增加小肠绒毛、瘤胃乳头长度，提高对营养物质的消化与吸收[27]。本试验研究中添加发酵枣粉提高了粗蛋白质、中性洗涤纤维、粗脂肪表观消化率，10%组粗蛋白质表观消化率显著高于对照组，主要原因是红枣多糖、黄酮类化合物等活性成分通过缓解肠道损伤，促进营养成分消化吸收，提高营养成分的利用率。

3.4 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛血清生化指标的影响

动物血液生化指标的变化反映着机体健康状况、营养水平以及机体内代谢状态。肉牛热应激时甲状腺机能降低，甲状腺T3、T4分泌量减少，从而降低物质代谢率，产热减少，以提高机体对热环境的适应性[28]。本试验中，各试验组血清中T3含量在整个试验期是逐渐下降的，其中对照组血清T3、T4含量下降幅度最大，添加发酵枣粉的试验组不仅在热应激期间血清T3、T4含量呈现出优于对照组的稳定，在热应激到非热应激的过度也展现出优于对照组的恢复能力。其中10%组血清T3、T4含量表现的稳定和恢复力是最为突出的，在整个试验期10%组血清T4含量并没有明显下降。

Cor是评定荷斯坦公牛热应激状态的黄金指标[29]，夏季动物血清中Cor含量显著高于冬季[30]，当机体处于高温环境时，垂体-肾上腺皮质轴活动增强，皮质醇分泌增加。本试验中，试验第90天，与对照组、5%组相比，10%、15%组奶公牛血清Cor含量显著降低，说明添加10%、15%发酵枣粉对缓解高温季节荷斯坦公牛应激有一定效果。

血清TP含量可以反映人体的营养状况和蛋白质代谢水平。一般来说，人体的营养状况良好，蛋白质合成增加，血清TP含量增加[29]。本试验中，第30天奶公牛10%组血清中TP含量显著高于对照组。这说明添加发酵枣粉提高了机体蛋白质代谢，其中添加量为10%效果最佳。

3.5 饲粮添加发酵枣粉对荷斯坦公牛血清抗氧化指标和免疫指标的影响

高温会引起线粒体底物氧化电子传递链活性加强，增加活性氧(ROS)和自由基的积累，加速动物机体的过氧化[31]，当氧化与抗氧化平衡被打破，引起氧化应激从而损伤机体。机体通过酶促系统(谷胱甘肽、维生素A等)与非酶促系统(SOD、GSH-Px)清除有害的氧自由基[32]，其作用方式是通过清除自由基和活性氧或清除具有催化作用的相关金属离子，降低过氧化反应效率达到抗氧化的作用。发酵枣粉中多酚类化合物[33]的羟基能与具有催化作用的Cu+、Fe2+发生螯合反应，降低氧化反应速率；发酵枣粉中黄酮类酚羟基[34-35]可与自由基反应形成稳定的半醌式自由基结构，减少自由基积累，从而提高抗氧化活性。MDA是脂质过氧化的终极产物，其含量可以间接说明氧化程度，判断机体损伤程度[35]。本试验添加发酵枣粉，血清中SOD、CAT、GSH-Px活性及T-AOC均有提高，荷斯坦公牛血清中MDA含量随着发酵枣粉添加量的增加而降低。这说明在发酵枣粉所富含的红枣多糖、酚类、皂苷等多种活性成分共同作用下能够增强机体的抗氧化能力。

细胞因子是机体免疫系统的重要部分，具有调节机体免疫作用。IL-1是一种促炎性因子[36]，大量的IL-1可造成机体免疫系统紊乱；有研究表明红枣多糖可通过下调髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB蛋白65(NF-κBp65)的表达，从而抑制白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌，进而提高肠道免疫功能[7]。IL-2能促进细胞因子的形成，具有广泛的免疫功能。IL-6可以具有分泌抗体的功能，它可以刺激并活化B细胞[37]。在本试验第30、90天，添加10%发酵枣粉血清中IL-1含量显著低于对照组。发酵枣粉中含有大量益生菌，可通过空间阻效应，在肠道表面提前形成1层保护膜，从而阻断病原菌的黏附，并刺激肠道黏膜中淋巴而产生体液免疫和细胞免疫，增强机体的抵抗力[38]。发酵枣粉的添加量十分关键，发酵枣粉添加量过高会导致的乳酸菌产生克隆无能，T细胞不能被激活，甚至被诱导凋亡或进入无能状态，无能状态的T细胞再接受抗原刺激时，即使有第二信号也不能再被激活，不能产生IL-2和IL-6[21]。因此高剂量的发酵饲料反而会降低机体免疫性能，起到促炎作用[39]，与本试验结果一致，试验第30、90天，饲喂含15%发酵枣粉饲粮血清中IL-2和IL-6的含量低于对照组，试验第90天，15%组血清IL-1含量显著增加，可见添加过量发酵枣粉具有促炎作用，降低了免疫功能。饲喂10%发酵枣粉能提高血清IL-2和IL-6含量，降低血清IL-1含量，提高IgA和IgG含量，从而达到提高荷斯坦公牛的免疫性能的效果。

4 结 论

在本试验条件下，从生长性能指标可以看出，饲粮添加10%发酵枣粉显著提高了荷斯坦公牛的粗蛋白质、粗脂肪表观消化率，同时其平均日增重提高了3.60%，胸围增长、体高增长、体斜长分别提高了11.81%、8.01%、9.17%。从免疫和抗氧化指标分析，添加10%发酵枣粉提高了荷斯坦公牛血清中抗氧化酶活性和免疫球蛋白的含量，有效提高了机体免疫性能及抗氧化性能。综上所述，添加10%发酵枣粉能够达到缓解高温对荷斯坦公牛机体氧化应激损伤，减弱对其生长性能的不良影响。